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    等温扩增技术的兴起无疑是对PCR的巨大挑战

    苏州达麦迪生物医学科技有限公司2018年2月28日 10:51 点击:502



    自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR,这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。近年来,等温扩增技术的兴起无疑是对PCR的巨大挑战。

      等温扩增技术的基因快速诊断方法,涉及生物检测技术领域,具体是用体外生物检测试?#37327;?#36895;检测病原微生物的一种技术。

      包括如下步骤:一、对被检样品进行预处理;二、包括目标靶基因数据库的建立;生物信息学的分析比较;基因组多态性的?#20013;?#22788;理和简并碱基的运用,获?#37238;?#31181;靶基因的特异性引物两对,分别与靶基因中的六个独立区域序列特异性匹配;三、进行等温扩增?#20174;?四、分析判断结果。该方法的优点:不需特殊试剂与设备;高特异性;.灵敏度高;鉴定简便;用途广: 可用于食品、药品、化妆品等领域的质量控制和环境、水质等监测;用于医学临床诊断,用于代谢性疾病和遗传疾病的基因诊断。

      英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)--被称为是可以替代PCR的核酸检测技术,目前全球最新的等温扩增检测技术。以此为基础的TwistAmp? 核酸扩增产品,能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对?#24067;?#35774;备的要求很低,特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。

    TWISTDX

      常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤,而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA?#20174;?#30340;最适温度在37°C - 42°C之间,无需变性,在常温?#24405;?#21487;进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外,由于不需要温控设备,RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

      据介绍,RPA检测的灵敏度很高,能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平,从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理,?#35270;?#20110;无法提取核酸的实地检测。

      RPA既可以扩增DNA?#37096;?#20197;扩增RNA,还省去了额外的cDNA合成步骤。你不仅可以对扩增产物进行终点检测,还可以对扩增过程进行实时监控,甚?#37327;?#20197;通过试纸条(侧流层析试纸条LFD)读取结果。

      目前,TwistAmp? 试剂盒的扩增子长度在500bp以内。不过,经过特别优化的RPA扩增,?#37096;?#20197;生成更长的扩增产物,或者减慢扩增速度(便于定量),甚至在更低的温度下进行?#20174;Α?/span>

      RPA技术的基本原理

      RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性,最佳?#20174;?#28201;度在37°C左右。

      重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链?#25442;环从?#24418;成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA?#20174;隨SB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成?#24405;?#25972;个过程进行得非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA扩增的基础体系(TwistAmp? Basic)含有DNA扩增所需的所有试剂,我们只要准备好引物和模板就行。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测,产物纯化后可用于下游研究。

      在这个基础体系中添入不同的酶和探针,就可以实现多样化的RPA应用。举例来说,TwistAmp? Basic RT添加了逆转录酶,可以对RNA模板进行一步法扩增。TwistAmp? exo结合了专利的exo探针技术和核酸外切酶III,能实现数据的实时读取,就像荧光定量PCR一样。不过?#20174;?#32456;点的扩增子总量?#20852;?#20943;少,适合获?#20204;?#33639;光信号进行动力学分析,不适合终点检测(比如跑胶)。将exo探针技术、核酸外切酶III和逆转录酶结合起来的 TwistAmp? exo RT,可以一步实现RNA模板的实时扩增。

      TwistAmp? fpg是一个添加了核酶fpg的实时报告体系。fpg探针技术的荧光累积比?#19979;?#20294;终点的扩增子产量不会减少,因此也能支?#31181;?#28857;分析。TwistAmp? nfo加入了核酶nfo,可以用“三明治法”进行终点检测,比如测流层析试纸条LFD。

      除此之外,RPA扩增还可以很简单的实现多重化。只需要增加引物/探针就可以一次性检测多个扩增产物。

      RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不?#35270;?#30340;,因为RPA引物比一般PCR引物长,通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率,影响扩增速度和检测灵敏度。

      在设计RPA引物时,变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟,用户需要自?#22909;?#26465;件进行优化。虽然还没有设计软件可以使用,不过TwistDx Inc公司在自己的网站上提供了相应的筛选指南。

      需要注意的是,目前的TwistAmp? 扩增试剂盒都没提供RNase?#31181;?#21058;。另外,受目前的生产方法所限,RPA?#20174;?#19981;适合用于E. coli标准实验室菌株的扩增。


    (来源: 苏州达麦迪生物医学科技有限公司


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