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    实验技术|蛋白免疫印迹WB(上)

    武汉华美生物工程有限公司2019年3月13日 11:39 点击:212

     

     



    Western Blot 
    对于任何一个科研菌都不陌生。
    BUT
    为甚么别人的实验,时间短跑胶快?
    除了实验精细化操作,
    当然也离不开选择最佳的试剂,
    和对关键实验步骤的优化设计。
    科研就像赛跑,你比别人跑的快,就比别人多发几篇SCI~
    阳春三月,咱们从WB说起……

    蛋白免疫印迹(WB)是基于抗原抗体的特异性结合作用,以检测复杂样品中的某种蛋白,并对其进行半定量分析的一种方法。
    主要用于靶标蛋白特异性表达的定性或半定量分析,蛋白与蛋白或蛋白与DNA相互作用的后续分析,以及蛋白修饰的鉴定分析。


     


    蛋白样品准备



    1.1 蛋白样品来源
    用于WB的蛋白样本可以是可溶性蛋白液,细胞组织裂解液,及免疫沉淀蛋白。对于不同样品蛋白上样量存在区别,纯蛋白建议不超过100 ng,细胞组织裂解液10-40 μg。
    1.2 蛋白样品制备
    一般从动植物组织或细胞中提取复杂蛋白成分,在提取过程中应遵守如下原则:
    ① 结合蛋白特性采用合?#23454;?#25552;取方法;
    ② 采用合?#23454;?#26041;法最大限度提取靶标蛋白;
    ③ 保持低温操作,并加入蛋白酶?#31181;?#21058;,防止蛋白降解;
    ④ 选择合?#23454;?#34507;白裂解液,以维持蛋白可溶性状态;
    ⑤ 蛋白样品-80℃低温保存或变性后保存,避免反复冻融,并尽快检测。
    细胞样本蛋白制备
    ?待细胞汇合度达到80%,取出培养皿(10 cm),此时细胞生长至对数期,活性良好。弃去培养液,加入预冷的PBS缓冲?#21512;?#28068;3次,置于冰上。
    ?配制含蛋白酶?#31181;?#21058;的裂解液,常用蛋白酶?#31181;?#21058;见下表,需根据实验要求选择合?#23454;?#34507;白酶?#31181;?#21058;。最常用的蛋白酶?#31181;?#21058;为PMSF(工作浓度1 mM),剧毒,使用时应注意自我防护,其在水中半衰期极短,故在临用前加入。
    ?加入1 mL含蛋白酶?#31181;?#21058;的蛋白裂解液于10 cm培养皿中,轻轻晃匀后,置于冰上裂解15-30 min。
    ?用干净的细胞刮迅速刮取细胞于一侧,并将含细胞碎片的裂解液转移至1.5 mLEp管中,置于冰上。此时应避免气泡产生。
    注:收集的细胞亦可通过超声破碎进行充分裂解。将超声探?#20998;?#20110;样本裂解液中部,但不触碰管壁或管底,进行超声。
    ?于4℃,12000 rpm离心10-15 min。
    ?轻轻取出EP管,用枪头吸去上层上清于新的EP管中,注意不要吸到上层漂浮的脂?#23454;?#26434;质,并置于冰上备用。
    ?经蛋白定量后,加入适量6×Sample loading buffer 95℃煮样5 min,12000 rpm离心30 s,-20℃保存。

    组织样本蛋白制备
    ?获取新?#39318;?#32455;样本,并用生理盐水或PBS洗涤干净,用洁净的剪刀将组织剪碎至合适大小。可采用1-2 mL匀浆器置于冰上进行组织匀浆,或加入液氮进行?#24515;ァ?#22240;组织块相对不易破坏,?#20197;?#21248;浆过程中存在摩擦产热,推荐采用液氮?#24515;ァ?/span>
    ?配制含蛋白酶?#31181;?#21058;的裂解液。 
    ?加入适量含蛋白酶?#31181;?#21058;的裂解液(50 mg/500 μL)于?#24515;?#21518;的组织样本中,将离心管置于冰上裂解15-30 min,期间进行间断混匀,以充分裂解。
    注?#20309;?#30830;保组织细胞充分裂解,建议进行超声破碎。调节超声仪至?#23460;?#39057;率与功率(超声功率不宜过大,并设置超声间歇,以防止超声探头过度产热),将超声探?#20998;?#20110;样本裂解液中部,但不触碰管壁或管底,进行冰浴超声。
    ?于4℃,12000 rpm离心10-15 min。
    ?轻轻取出EP管,用枪头吸去上层上清于新的EP管中,注意不要吸到上层漂浮的脂?#23454;?#26434;质,并置于冰上备用。 
    ?经蛋白定量后,加入适量的6×Sample loading buffer 95℃煮样,12000 rpm离心30 s,-20℃保存。
     
    1.3 蛋白裂解液的选择
    蛋白裂解液的主要成分及其作用如下:
    1. 缓冲体系
    一定pH范围的缓冲体系,为蛋白提供了一?#37995;?#23450;环?#24120;?#24182;增加蛋白溶解?#21462;?#24120;用近似生理pH状态的Tris-HCl或HEPES缓冲体系,pH7.4。Tris-HCl(pKa=8.1)pH缓冲范围为7.0-9.2,其对温度较为敏?#23567;EPES(pKa=7.55)pH缓冲范围为6.5-8.5。
    2. 盐离子
    在?#23454;?#30416;离?#20248;?#24230;下,保持蛋白溶解状态。选择近似生理状态下的150 mM的NaCl,不会对破坏蛋白以及蛋白间相互作用产生影响。
    3. 螯合剂
    螯合金属离子,以防止蛋白提取物过于黏稠,导致溶解度下降。另外,螯合剂亦可与某些酶发生相互作用,以?#31181;?#37238;活性。
    4. 还原剂
    加入一定量的还原剂保护蛋白质上?#26434;?#30340;巯基不被氧化,从而避免蛋白?#23454;?#32858;集或变性。常用β-巯基乙醇或二硫苏糖?#36857;―TT),后者还原能力强于前者。β-巯基乙醇具有挥发性,加入缓冲液中以后较短时间内会被氧化,会对蛋白活性产生影响,其使用浓?#20219;?-20 mM/L。而DTT具有更强的还原能力,?#20197;?#27687;化以后能够形成稳定的分子内二硫键,不会影响蛋白巯基,使用浓度相对偏低为0.5-1 mM/L。长期保存建议使用DTT,但DTT溶液不稳定,需要现配现用。
    5. 去垢剂
    去垢剂即表面活性剂,其通过分子结构特征,表面活性剂分子的疏水段插入膜的磷脂双分子层,而改变其通透性,最终破?#30340;?#32467;构。因此,表面活性剂的强度直接决定了裂解细胞的强?#21462;?#35010;解液中所使用的表面活性剂主要可分为两大类:阴离?#26377;?#34920;面活性剂和非离?#26377;?#34920;面活性剂。常用表面活性剂如下:
    十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子表面活性剂,具有很强的破坏力,基本可以使所有的蛋白溶解,并破坏其天然构象结构。SDS与蛋白分子以1.4:1的比例进行结合,可以?#34892;?#30340;覆盖蛋白本身所带的电荷情况。SDS的临界胶束温度?#32454;擼?#22312;低温时即会发生沉淀,?#20197;?#38078;盐存在时,沉淀效果会更明显。另外溶液离子强度越强,会降低离?#26377;?#21435;污剂的临界胶束浓度,使得这种蛋白溶解效果更强。
    脱氧胆酸钠(NaDOC):也是一种离?#26377;?#34920;面活性剂,作用较SDS弱。
    Triton X-100:是一种非离?#26377;?#34920;面活性剂。可以破坏蛋白质与脂质间的相互作用,但并不使蛋白变性,也不破坏蛋白与蛋白间的连接,能够保留蛋白?#23454;?#22825;然构象。其具有较低的临界胶束浓度,在64℃下,可观察到两相分离。
    NP-40:非离?#26377;?#34920;面活性剂,对核膜的破坏作用较弱,与蛋白结合力强,可确保蛋白的充分溶解和结?#21038;?#23450;,特别适用于膜蛋白非变形条件下的溶解。
    Tween 20:温和非离?#26377;?#34920;面活性剂,蛋白溶解能力较弱,也不会破坏蛋白结构,并不作为蛋白裂解液的常见成分。
    去污剂的选择取决于所要提取蛋白的性质与实验目的。需要充分裂解细胞,并溶解蛋白,对于提取后蛋白的状态(变性还是保留天然状态)都是需要考虑的问题。
    6. 蛋白酶?#31181;?#21058;
    由于在蛋白提取过程中,细胞和组织被破坏,大量蛋白酶被?#22836;擰?#38500;了保持在低温条件下操作以?#31181;?#34507;白酶活性外,还应加入适量蛋白酶?#31181;?#21058;以?#31181;?#34507;白酶的活性,防止目的蛋白的降解。常用蛋白酶?#31181;?#21058;如下表:
     


    蛋白定量


    为了对样品中的目的蛋白进行相对定量,需要对样品间的总蛋白量进行检测。在总蛋白含量一定的情况下,体现目的蛋白的表达差异。常用化学定量方法如下:
    最常使用的蛋白定量方法是BCA法和Bradford法。但当所使用裂解液中含有高浓?#28909;?#22434;剂时,推荐使用BCA法定量蛋白。
    2.1 Bradford法标准曲线的绘制
    1.标准蛋白质溶液配制:
    10 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)标准品。准确称取0.05 g牛血清白蛋白,溶于5 mL PBS中,即为10 mg/mL牛血清白蛋白。
    2.考马斯亮蓝G-250染色液配制:
    称取50 mg考马斯亮蓝G-250,溶于25 mL 90%乙醇中,加入85%的磷酸50 mL,最后用纯水定容到500 mL,考马斯亮?#24230;?#33394;液需避光保存。
    3.稀释待测蛋白:
    将蛋白稀释三种不同梯度的浓度10倍,20倍,40倍。
    4.稀释标曲:
    将标准品稀释8种不同浓度梯度:
    浓度梯度12345678
    浓度(mg/mL)00.050.0750.10.150.20.30.4
    5.将稀释好的标曲和样品各取20 μL?#27492;?#24207;?#26469;?#21152;入到酶标孔条中,然后再?#26469;?#21152;入G250染色液180 μL,混?#21462;?nbsp;
    6.在酶标仪595 nm处测定吸光值,根据吸光?#24213;?#20986;标准曲线,并根据标准曲线计算蛋白浓?#21462;?nbsp;
    2.2 BCA检测法
    1.根据蛋白数量,按50:1(V/V)的BCA试剂A与B配置BCA工作液,室温24 h内稳定;
    2.溶解标准品,使终浓?#20219;?.5 mg/mL。所用溶剂与样品所用溶剂相同;
    3.将标准品按照0,1,2,4,8,12,16,20 μL体积加入到酶标板中,并加标准品稀释液补足到20 μL;
    4.向个孔中加入200 μL BCA工作液,于37℃放置30 min;
    5.酶标仪检测562 nm处吸光度值;
    6.根据绘制的标准曲线计算出样品蛋白浓?#21462;?/span>


    上 样



    3.1 蛋白样品制备
    变性蛋白,破坏蛋白三级结构,暴露抗原表位,便于抗体结合与后续检测。将定量后的蛋白加入等体积2×Sample loading buffer 或1/5体积6×Sample loading buffer,于95℃加热煮沸5 min。
    对于膜蛋白,由于高温会使得其聚集沉淀,在37℃处理30 min即可。
    6×Sample loading buffer 配方如下:
    6%Tris(pH6.8)(V/V)
    4%SDS(W/V)
    0.2%溴汾蓝(W/V)
    20%甘油(V/V)
    9%DTT(V/V)
    ● 注意事项:
    蛋白溶液上样量以10-40 μg/孔为宜,避免上样量超载,造成拖尾。

    本期给大家带来WB前三节的介绍
    ~下期干货继续噢~


    下期预告~
    1.蛋白样品准备
    2.蛋白定量
    3.上样
    4.凝胶电泳
    5.转膜
    6.封闭
    7.孵育一抗
    8.孵育二抗
    9.?#26434;?/strong>
    10.常见问题
     
    —未完·待续—
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    (来源: 武汉华美生物工程有限公司


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