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    基因组DNA提取常见问题分析

    武汉鸿雨新科技有限公司2010年1月26日 10:25 点击:3007

    洗脱产物的
    DNA量很少
    或没有
    常见问题 可能原因 建议解决方案
    所提样品材料老化或反复冻
    融导致基因组DNA含量下降
    应选择新鲜的样品材料,如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩的植物组织
    等,不能及?#36125;?#29702;的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存,以免DNA降解。
    样品破壁或裂解不完全导
    致基因组DNA未充分释放
    动、植物材料应在液氮中充分?#24515;?#21248;浆,G+细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌
    酶、酵母破壁酶或机械方式协助破壁,不同样品的细胞破壁方式可参照前面的详细介绍。
    样品量过多导致细胞
    裂解不充分
    加样量过多使裂解液?#33073;?#21697;混合不均匀,细胞裂解不充分。不同来源样品的加样量请参照
    详细操作步骤。
    DNA吸附不充分如在上吸附柱前未加无水乙醇,或用低浓度乙?#21363;?#26367;无水乙醇,则导致DNA不能充分沉
    淀,与硅胶膜吸附不彻底,因此应在样品裂解后加适量无水乙醇,再上吸附柱使DNA与硅
    胶膜充分吸附。
    DNA洗脱不?#23454;?#27927;脱液pH值过低会降低洗脱效率,应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间;洗脱体积若小于30μl,则不
    易完全浸透硅胶膜,使DNA不能全部洗脱下来,因此洗脱液体积应大于30 μl,同时如洗脱液体积
    过大,超过200μl,则所得的DNA浓度会降低,但DNA总量不会减少;洗脱时可将洗脱缓冲液在
    65-70℃水浴预热,加入洗脱液后在室温静置2-5分钟,可提高洗脱效率,提高基因组DNA的产量。
    提取的基因
    组DNA有降

    选取的材料不新鲜或反
    复冻融,采集材料后未
    及?#36125;?#29702;或未低温保存
    陈旧血液、老化菌液等不新鲜的材料中,细胞凋亡导致DNA降解,或低温保存的样品反复
    冻融导致细胞破碎,内源核酸酶降解DNA,因此应选择新鲜的材料样品,不能及?#36125;?#29702;则
    低温保存,运输过程中亦应使用干冰。
    未能?#34892;?#25233;制内源核
    酸酶作用
    某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中?#24515;?#25110;匀浆,?#24515;?#36807;程中应随时补
    充液氮,并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
    操作过于剧?#19994;?#33268;
    DNA被机械打断
    预处理的样品加入细胞裂解液后,所有操作应尽量柔和,避免振荡、搅拌等剧烈机械力对
    DNA片段的损伤。
    提取的基因
    组DNA中有
    RNA污染
    实验过程中没有?#34892;?br /> 使用RNase A
    应严格按照实验操作要求使用,即加入裂解液的同时加入20μl RNase A溶液,室温放置
    10分钟。
    RNAase A可能失活RNase A须在-20℃下保存,低温保存时RNase A比较稳定,不?#36164;?#27963;,但如果反复冻融
    会导致RNase A降解失活,所以应妥善保存。
    提取的基因
    组DNA不能
    顺利地进行
    后续试验
    样品量过多导致细胞
    裂解不充分
    样品量过多会使裂解液不能快速?#34892;?#22320;与样品充分混合,从而导致样品裂解不彻底,残留
    大量蛋白、多糖、脂类等杂质,为后续的上吸附柱分离纯化造成影响。应加入?#23454;?#37327;的样
    品材料,具体数量请参照详细操作步骤。
    DNA在洗脱前有大量
    乙醇残留
    有机溶剂乙醇可?#29616;?#25233;制内切酶、DNA聚合酶的活性,而在DNA过柱洗涤过程?#34892;?#20351;用
    含有乙醇的漂洗液,因此在洗脱DNA前,—定要充分去除残留的乙醇,可重复离心,或将
    吸附柱置于室温或50℃温箱中烘干5-10分钟,再加洗脱液。

    (来源: 武汉鸿雨新科技有限公司


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