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    双判定标准判定qPCR扩增特异性,提升Ct值真实性

    上海?#35789;?#29983;物科技有限公司2019年3月21日 4:29 点击:145

    双判定标准判定qPCR扩增特异性,提升Ct值真实性

    让实验小白?#37096;?#20197;做出好的qPCR结果

     

    qPCR实验易做,但数据分析并非想象中的那么容易!数据分析的好与坏,极大程度上依赖于qPCR原始结果的质量。

    qPCR结果的评价指标

    ?溶解曲线,是qPCR结果判定的第一要素。它的作用是判定目的基因是否得到扩增。理论上,当反应体系中仅是目标基因的扩增,才是?#34892;?#25193;增。

    ?标准曲线,是qPCR结果判定的金标准。(在溶解曲线判定为特异性扩增后)它的作用是测定引物的扩增效?#22987;?#35797;剂的检测上下限。根据文章发表对于qPCR数据的要求,扩增效率应在90-110%。

    ?扩增曲线,是直接生成qPCR定量的数据,即Ct值。从试剂?#21592;?#35282;度而言,Ct值大小常被用于判定试剂扩增效?#23454;?#39640;低。

    产品描述

    Hieff Unicon? Power qPCR SYBR Green Master Mix,这是一款旨在解决诸多qPCR实验常见疑难问题的qPCR试剂:

    ?它减少了大量引物验证的预实验工作,是一款具备强引物兼容性的Mix,

    ?它明确了qPCR溶解曲线峰型的标准——“单峰的形状?#20445;?#23545;于“什么溶解曲线是好的溶解曲线”的解读具有参考意义,

    ?它让时间不再碎片化,1次体系配制,24 h时间自由支配

    产品特点

    □引物兼容性强:针对遵循qPCR引物设计原则设计的引物,使用Hieff Unicon? Power 引物使用率可达97%;

    □模板加入量灵活:可检测10-107个拷贝个数的基因片段;

    □特异性高:标准溶解曲线峰型,?#34892;?#36991;免“胖”峰、“多”峰的出现;

    □稳定性强:产品经50次反复冻融验证,扩增性能无变化;

    □操作灵活:配制好的qPCR反应液4℃保存24 h,扩增性能无变化;

    □扩增时间短:每个扩增循环中,退火、?#30001;?#19968;步完成,用时15 sec。

    产品性能展示

    1. 超高特异性,简化了qPCR实验的引物设计

     

    图1. Hieff? Unicon Power预混液实现了引物的高特异性扩增  以293T细胞cDNA为模板,利用Prime5软件设计200bp扩增长度的片段(GC含量:30%-70%)的引物共1000对,随机挑选88对,使用Hieff Unicon? Power预混液测定引物的扩增特异性。通过溶解曲线分析,88个检测片段中有86个(97.7%)目标片段?#34892;?#25193;增,?#24471;鱄ieff Unicon? Power预混液引物兼容性强,具备高特异性扩增、高检出?#23454;?#29305;点。

     

    2. 超高特异性,保证了Ct值的真实性

     

    图2. Hieff? Unicon Power预混液扩增高度特异,Ct值结果可信度高  以1 ng人gDNA为模板,使用不同品牌预混液按照标准扩增程序,扩增5个目的基因片段,经琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物情况。结果显示Hieff Unicon? Power预混液针对不同靶标基因均可以高特异性扩增,得到最可信的靶标片段Ct值。

     

    3. 检测?#27573;?#23485;广,模板添加不再纠结

       

    图3. Hieff? Unicon Power预混液可?#34892;?#26816;测6个数量级?#27573;?#30340;模板量  以质粒DNA为模板,10?#30701;?#24230;稀释(107-101 拷贝/μl),扩增IL23R基因。结果显示Hieff Unicon? Power预混液扩增特异,线性相关性高,可在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

     

    4. 良好的稳定性,让体系配制更加灵活:

     

    冻融次数

    0

    10

    30

    50

    Ct均值

    22.97

    22.87

    22.99

    22.84

    Ct

    -

    -0.09

    0.02

    -0.12

     

     

     

     

    4℃保存时间

    0 h

    24 h

    48 h

    72 h

    Ct均值

    22.83

    22.89

    23.05

    23.16

    Ct

    -

    0.06

    0.22

    0.33

     

     

     

    图4. Hieff? Unicon Power预混液及其配制体系稳定性俱佳  以1 ng 人gDNA为模板,使用Hieff Unicon? Power预混液在不同冻融次数或体系配制后4℃放置不同时间条件下,检测TFRC基因扩增情况。结果显示Hieff Unicon? Power预混液经50次反复冻融或体系配制后4℃保存24h,扩增性能无变化(溶解曲线图数据未做展示)。

     

    5. 兼容快速程序与标准程序:

     

     

    30%GC-1

    30%GC-2

    50%GC-1

    50%GC-2

    70%GC-1

    70%GC-2

    标准程序

    23.4

    22.79

    23.79

    23.52

    23.23

    23.60

    快速程序

    23.29

    23.04

    23.8

    23.57

    23.48

    23.52

    Ct

    0.11

    0.25

    0.01

    0.05

    0.15

    0.08

     

     

     

     

     

    标准程序                                                快速程序

     

    95         5 min                                       95         30 sec   

    95         10 sec                                      95         10 sec

    60         30 sec     40 Cycles                        60         15 sec    40 Cycles

     

    图6. Hieff? Unicon Power预混液让扩增时间大大缩短 以1 ng人gDNA为模板,扩增不同GC基因片段(30-70%),比较Hieff Unicon? Power预混液在标准程序和快速程序下的扩增效果。结果显示Hieff Unicon? Power预混液可兼容快速扩增程序和标准扩增程序,使用快速程序可缩短扩增时间。

     

    常见问题

    Q:如何选择产品?

    A

    产品名称

    货号

    特异性

    扩增效率

    灵敏度

    性价比

    Hieff UNICON? Power qPCR SYBR Green Master   Mix

    11195ES

    ★★★★★

    ★★★★☆

    ★★★☆☆

    ★★★☆☆

    Hieff UNICON? qPCR SYBR Green Master   Mix 

    11198ES

    ★★★★☆

    ★★★★☆

    ★★★★☆

    ★★★★☆

    Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix

    11201ES

    ★★★★☆

    ★★★★★

    ★★★☆☆

    ★★★★★

     

    Q:Hieff UNICON? Power qPCR SYBR Green Master Mix产品可应用于哪些实验?

    A:可用于对特异性要求比较高或较难实现特异性扩增的基因片段。这款产品极大程度上避免了引物二聚体、非特异性扩增的出现,特别适合于引物中有单个碱基不同的扩增。

     

    Q:建议的模板加入量?

    A:20 μL反应体系,未经稀释的cDNA加入量建议不超过2 μL。

     

    Q:试剂如?#26410;?#23384;及保质期?

    A:建议-20℃保存,?#34892;?#26399;1年。

     

    订购信息

    产品名称

    货号

    规格

    价格(元)

    促销价(元)

    Hieff UNICON? Power qPCR SYBR Green Master   Mix (抗体法,No Rox)

    11195ES08

    5 ml

     

     

    Hieff UNICON? Power qPCR SYBR Green Master   Mix (抗体法,Low Rox)

    11196ES08

    5 ml

     

     

    Hieff UNICON? Power qPCR SYBR Green Master   Mix (抗体法,High Rox)

    11197ES08

    5 ml

     

     

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    11201ES08

    5 ml

    740.00

    498.00

    Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox   Plus)

    11202ES08

    5 ml

    740.00

    498.00

    Hieff? qPCR SYBR? Green Master Mix (High Rox   Plus)

    11203ES08

    5 ml

    740.00

    498.00

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    (来源: 上海?#35789;?#29983;物科技有限公司


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