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    逆转录实验做不好,是不是引物出了问题

    上海?#35789;?#29983;物科技有限公司2019年3月19日 5:00 点击:326

     

    逆转录实验做不好,是不是引物出了问题

    实验?#39029;?#29992;到的实验:逆转录实验

    实验人员通过体外模拟病毒复制过程,以提取的RNA为模板,使用逆转录?#22797;?#21270;,合成出与RNA互补的cDNA链。最?#23637;?#24314;cDNA文库,并从中筛选所需的靶标基因。

    BUT!小伙伴们做逆转录实验时,

    1)有没有深究过RNA逆转录出的cDNA能不能真实?#20174;?#20986;基因表达信息?

    2)做实验时,有没有发生过内参做的很好,目的基因做不出的情况?

    如果有发生上述情况,那么需要重新评估逆转录实验结果的?#34892;?#24615;。

     

    逆转录结果?#34892;?#24615;的评定

    逆转录实验结果?#34892;?#24615;的评定最重要的是尽可能?#20174;?#26679;本中原始RNA模板的信息,即均一性地将RNA逆转录生成cDNA。理论上来讲,不考虑碱基组成的影响,均一性体现在不同位置处的片段同等效?#23454;?#21512;成cDNA,进而保证真实地?#20174;?#36716;录谱中不同基因的实际丰?#21462;?/span>

    逆转录实验的成功与RNA模板、逆转录酶、引物及反应程序等有关。当我们实验做不成功时,大家会优先从模板、逆转录酶来?#20197;?#22240;,往往忽略引物在其中起的作用,其实引物对逆转录成败也至关重要。

    今天小翊就跟大家讨论下逆转录引物的分类和选择。

     

    逆转引物的分类和选择

    逆转录引物有三类,Oligo dT引物、随机引物、基因特异性引物(GSPGene Specific Primer)。

    1Oligo dT引物:

    若干dTTP组成的引物,可以和真核生物mRNAPoly A尾配对,与模板结合特异性高。因该特异性,常适用于获取转录本靠近3’末端序列。它不适用于降解的RNA模板,也不适用于缺少A尾的RNA,如原核生物RNAmiRNA。当RNA模板降解时或RNA内部中有复杂二级结构时,会造成cDNA合成长度变短,无法?#34892;?#21512;成靠近RNA 模板5’末端的序列。这是影响均一性的常见因素。

    也常见Oligo dT序列的3’端存在几个锚定碱基,如常见的miRNA加尾法逆转录引物。

    逆转录2.png

    2)随机引物

    随机引物是若?#31579;?#30897;基组成的寡核苷酸,如随机六聚体,5’-dNNNNNN-3’,是各种引物的混合物。它与模板结合的特异性低,可在整个转录本的多?#37995;?#28857;退火,产生短的、部分长度的cDNA。常适用于获取转录本5’末端序列及二级复杂结构的区域。一般不建议用于长片段序列的合成。有文献报道15个碱基的随机引物比6碱基和9碱基随机引物转录出的cDNA产量和基因丰度更高[1]

    3)基因特异性引物(GSP)

    基因特异性引物(GSP)?#24067;?#26159;反向引物,是与模板序列互补的引物,需要实验者根据实验需求自己设计合成,适用于目的序列已知的情况。若做一步法RT-PCR,只能用GSP引物。设计GSP的原则同PCR引物相同。

    若研?#31354;?#26680;基因时,?#23665;?/span>Oligo dT与随机引物混合使用,集二者之长,得到的cDNA均一性更好。实验重复性也更高。

    对三种引物有初步了解后,针对一些实验中遇到的问题,小翊给大家提供了实验建议。

     

    实验建议

    问题一:大鼠肝脏的RT-qPCR,逆转录用的是oligo dT引物,PCR时内参出的很好,就是目的基因不出,已经差不多一个月了。怎么办?

    小翊建议:根据Oligo dT引物介绍,具有明显二级结构的RNA?#19981;?#30772;坏全长cDNA的合成,造成RNA 5’末端的代表性下降。同样的,RNA模板出现降解时,?#19981;?#36896;成Oligo dT全长cDNA合成能力的下降。建议使用Oligo dT/随机引物的混合物作为逆转录启动引物。

    问题二:RNA模板有降解怎么办?

    小翊建议:尽量选用RNA质量好的样本,但是如果条件不允许,建议用随机引物,适合poly A比较短或被降解的情况做逆转录。

    问题三:RNA病毒研究用什么引物?

    小翊建议:在RNA病?#38236;?#30740;究中一般用随机引物和基因特异性引物。一方面是病毒RNA没有PolyA的原因。另一方面,当复杂二级结构较多时,使用基因特异性引物有利于提高退火温度,打开二级结构,合成较长的cDNA片段。

    好啦,逆转录引物的介绍就到这里啦,期望对小伙伴的实验有所帮助。

     

    参考文献

    [1] Stangegaard M1, Dufva IH, Dufva M.Reverse transcription using random pentadecamer primers increases yield and quality of resulting cDNA[J].Biotechniques,2006 May,40(5):649-57.

    往期内容:

    1.     掌握这几个影响因素,你的反转录实验就完美了

    2.     【明星推荐】反转录系列产?#36153;?#25321;指南

     


    (来源: 上海?#35789;?#29983;物科技有限公司


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