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    细胞融合技术

    互联网2008年10月9日 7:08 点击:4658

    细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)是指真核细胞通过介导和培养,两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。人工的细胞融合开始于20世纪50年代, 60年代到70代作为一门新兴的技术, 发展非常快, 应用范围?#24067;?#20026;广泛, 除了同种类细胞间可以融合, 种间远缘细胞也能融合, 细胞与组织不同, 不排斥异类、异种细胞, 动物细胞如此,植物细胞也是如此。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon);来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。
    目前, 诱导细胞融合的方法有三种:病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)(Pontecorvo, 1975)和电激(Zimermann, 1980s)。副粘病毒科的病毒,如副流感病毒(Sendai virus)和新城鸡瘟病毒,在其被膜中目前发现了两种糖蛋白。较大的一种具有粘附细胞和凝血的作用;较小的一种可介导病毒同宿主细胞融合, ?#37096;?#35825;导细胞与细胞融合,称为融合蛋白(fusion protein)。人工利用病毒诱导细胞融合即是利用病毒的这一特性, 使用时先用紫外线将病毒灭活, 稀释到一定浓度加入到细胞悬液中, 诱导细胞融合。但病毒介导细胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖与灭活,操作繁琐,如灭活不完全则易对实验人员造成伤害,因此现在一般不使用此方法。后两种方法则是利用化学和物理手段,暂时使质膜脂类分子的?#34892;?#25490;列发生改变,待去掉作用因素之后,质膜?#25351;?#21407;有的?#34892;?#32467;构,在?#25351;?#36807;程中便有可诱导相接触的细胞发生融合。总之,这3种方法都是在相互接触的两细胞进行自我修复过程中融合的。
    细胞融合不仅可用于生物学的基础理论研究,而且在生产?#23548;?#19978;还有重要的应用价值,如目前在单克隆抗体的制备, 核质关系, 体细胞的遗传和发育, 新品种的培养, 免疫作用, 疾病的?#30239;?#21644;性状的改良, 潜伏病毒的研究等,已取得了显著的成绩。
    1.实 验 目 的
    1.1. 通过PEG介导的鸡血细胞融合实验, 对体细胞融合有一个清楚的概念
    1.2. 并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术
    2.实 验 原 理
    利用PEG介导的动物细胞融合,其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为,PEG改变各类细胞的膜结构,使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排,再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用,引起相临的重排质膜在修?#35789;?#30456;互合并在一起, 使两细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
    利用PEG介导细胞融合, 其融合效果受以?#24405;?#31181;因素的影响。1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比;但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者,在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000,浓度一般为40~60%。2. PEG的pH值: 经验证,PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3. PEG的处理时间: 处理时间越长,融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可?#23454;?#25918;宽至数分钟。4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动?#26434;?#28201;度成正比,故细胞的融合效果也与温度成正?#21462;?#22240;此,为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可?#23454;?#25552;高处理的温度。?#26434;?#21754;乳动物的细, 一般采用的温度为38~40℃。
    本实验所用材料为鸡的血细胞,这是因为: 1. 鸡血细胞具有细胞核,便于对融合细胞进行鉴别;2. 实验材料便宜、易得。细胞融合与否,可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核,定为未融合细胞;有二至多个核,定为融合细胞。
    3.实 验 用 品
    3.1 器材
    3.1.1 主要设备: 普通离心机、普通光学显微镜
    3.1.2. 小型器材: 100ml量筒2个, 滴管10支, 10ml刻度离心管20支, 载、盖片各20片
    3.2 材料 新?#22987;?#34880;
    3.3 试剂
    3.3.1. Alsever液制备
    葡萄糖(Glucose) 2.05g
    枸椽酸钠 0.8g
    氯化钠(NaCl) 0.42g
    重蒸水 至100ml
    3.3.2. 0.85%生理盐水液
    3.3.3. GKN液
    氯化钠 8g
    氯化钾(KCl) 0.4g
    Na2HPO4•2H2O 1.77g
    NaH2PO4•H2O 0.69g
    葡萄糖 2g
    酚红(phenolred) 0.01g
    溶于1000ml重蒸水中。
    3.3.4. 50% PEG液 (现用现配)
    根据实验需要,称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内,在酒精灯上将其加热熔化,待冷却至50℃,加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混?#21462;?
    4.实 验 方 法
    将Alsever液与活鸡翼?#24405;?#34880;混成1:4悬液 (抗凝效果最佳)

    4度冰箱保存

    取上述悬液加入生理盐水混匀

    1200r/min离心5分钟
    ↓弃上清
    上述离心速?#25163;?#22797;离心两次(5min, 10min)
    (以达到去除细胞表面粘附物质的目的)
    ↓弃上清
    加入适量GKN液,配成细胞悬液

    取悬液以血球计数法计数

    再用GKN液将红细胞的浓度稀释

    加入 50%的PEG液混匀

    吸取1~2滴?#23548;?#24182;计算出融合率
    5.实 验 结 果
    经PEG处理后,在显微镜下,可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。
    细胞的融合率指在显微镜的视野内,已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之?#21462;?#21487;用如下公式表示:

    在实验中统计融合率时, 要进行多个视野计数,然后再加以平均,以使计算更为准确。

    (来源: 互联网 )


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