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    小鼠基质金属蛋白酶2(MMP-2)ELISA试剂盒使用说明书

    厦门慧嘉生物科技有限公司2010年1月28日 10:07 点击:1297

    小鼠基质金属蛋白酶2(MMP-2)ELISA试剂盒使用说明书

    本试剂盒仅供研究使用                                       

    预期应用

    ELISA法定量测定小鼠血清、血浆或其它相关液体中基质金属蛋白酶2/明胶酶A(MMP-2/Gelatinase A)含量。

    实验原理

    本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中MMP-2/Gelatinase A水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中?#26469;?#21152;入MMP-2/Gelatinase A抗原、生物素化的抗小鼠MMP-2/Gelatinase A抗体、HRP标记的亲?#36864;?/span>,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MMP-2/Gelatinase A?#25910;?#30456;关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

    试剂盒组成及试剂配制

    1.         酶联板:一块(96孔)

    2.         标准品(冻干品):2瓶,?#31185;?#20020;用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为20,000 pg/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释20,000 pg/ml10,000 pg/ml5,000 pg/ml2,500 pg/ml1,250 pg/ml625 pg/ml312 pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml,临用前15分钟内配制。

    如配制10,000 pg/ml标准品:取0.5ml 20,000 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀?#32431;桑?#20854;余浓度以此类推。

    3.         样品稀释液1×20ml/瓶。

    4.         检测稀释液A1×10ml/瓶。

    5.         检测稀释液B1×10ml/瓶。

    6.         检测溶液A1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先计算好的?#30475;?#23454;验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

    7.         检测溶液B1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A

    8.         底物溶液1×10ml/瓶。

    9.         浓洗涤液1×30ml/瓶,使用时?#31185;?#29992;蒸馏水稀释25倍。

    10.     终止液1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

    标本的采集及保存

    1.  细胞培养物上清:请离心后收集上清,并将标本保存于-20且应避免反复冻融。

    2.  血清:标本请于室温放置2小时或4过?#36141;?#20110;1000 x g离心20分钟,取上清?#32431;?#26816;测,或将标本放于-20保存,但应避免反复冻融。

    3.  血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

    注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

     

    操作步骤

    实验开?#35760;埃?#35831;提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀?#26412;?#37327;避免起泡。?#30475;?#26816;测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。

    1.         加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul余孔分别加标准品或待测样品100ul,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37反应120分钟。

    为保证实验结果?#34892;?#24615;,?#30475;?#23454;验请使用新的标准品溶液。

    2.         弃去液体,甩干,不用洗涤。每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">检测溶液A工作液 100ul(取1ul检测溶液A99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37,60分钟。

    3.         温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,?#30475;?#28024;泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干(?#37096;?#36731;拍将孔内液体拍干)。

    4.         每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100ul3760分钟。

    5.         温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,?#30475;?#28024;泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干(?#37096;?#36731;拍将孔内液体拍干)。

    6.         依序每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">底物溶液90ul37避光显色30分钟内,此?#27604;?#30524;可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,?#32431;?#32456;止)。

    7.         依序每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">终止溶液50ul,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。

    8.         用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

    1.         ?#30475;?#23454;验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只?#20146;?#21518;加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

    2.         为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。

    3.         未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

    4.         建议检测样品?#26412;?#35774;双孔测定,?#21592;?#35777;检测结果的准确性。

    洗板方法
    手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫?#35206;?strong>

    纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需

    要,重复此过程数次。
    自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程?#23567;?/span>

    特异性

        本试剂盒可同时检测重组或天然的小鼠MMP-2/Gelatinase A,且与其它相关蛋白无交叉反应。

    计算

      ?#21592;?#20934;物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD?#28068;?#26631;准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,?#27425;?#26679;品的实际浓度。

    注意事项

    1.         洗涤过程?#27973;?#37325;要,不充分的洗涤?#33258;?#25104;假阳性。

    2.         一次加样时间最?#27599;?#21046;在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

    3.         请?#30475;?#27979;定的同时做标准曲线,最好做?#32431;住?/font>

    4.         如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。

    5.         在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。

    6.         底物请避光保存。

    检测范围:

    312 pg/ml - 20,000 pg/ml

    说明

    1.         试剂盒保存:-20(较长时间不用时,仅适用于部?#36136;?#21058;);2-8(频繁使用时)。

    2.         ?#34892;?#26399;:6个月

    3.         浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。

    4.         刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,?#23435;?#27491;常现象,不会对实验结果造成任何影响。

    5.         ?#23567;?#33521;文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。

     

    厦门慧嘉生物科技有限公司专业代理众多国际生命科学领域的知名品牌。致力于各种ELISA试剂盒、免疫组化试剂?#23567;?/span>一抗二抗、细胞因子、生物试剂、移液器、耗材的销售推广及服务工作。

    源?#25918;?#21457;试剂盒诚招全国合作经销商!!!
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    (来源: 厦门慧嘉生物科技有限公司


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