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    人类疾病的动物模型

    来宝网2007年4月5日 21:37 点击:1670

    人类疾病的动物模型

    人类疾病的动物模型
    第一节 概念及意义

      一、概念
      人类疾病的动物模型(animal model of human disease) 是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。
      动物疾病模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学(包括新药筛选)研究。人类疾病的发展十?#25351;?#26434;,以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制,推动医药学的发展来之缓慢,临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性,而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究,可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素,?#21592;?#26356;准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究,有助于更方便,更?#34892;?#22320;认识人类疾病的发生发展规律,研究防治措施。
      二、动物模型在生物医学中的意义
      1. ?#31579;?#21046; 临?#37319;?#19968;些疾病不常见,如放射病、毒气中毒、烈性传染病、外伤、肿瘤等。还有一些如遗传性、免疫性、代谢性和内分泌、血液等疾病,发生发展缓慢、潜伏期长,病程也长,可能几年或几十年,在人体很难进行3?#26469;?#20197;上的连续观察。人们可有意选用动物种群中发病率高的动物,通过不同手段复制出各种模型,在人为设计的实验条件下反复观察和研究,甚?#37327;?#36827;行几十?#26469;?#30340;观察,同时也避免了人体实验造成的伤害。
      2. 可按需要取样 动物模型作为人类疾病的“复制品”,可按研究者的需要随时采集各种样品或分批处死动物收集标本,以了解疾病全过程,这是临床难以办到的。
      3. 可比性 一般疾病多为零散发生,在同一时期内,很难获得一定数量的定性材料,而模型动物不仅在群体数量上容易得到满足,而且可以在方法学上严格控制实验条件,在对饲养条件及遗传、微生物、营养等因素严格控制的情况下,通过物理、化学或生物因素的作用,限制实验的可变因子,并排除研究过程中其它因素的影响,取得条件一致的、数量较大的模型材料,从而提高实验结果的可比性和重复性,使所得到的成果更准确更深入。
      4. 有助于全面认识疾病的本质 在临?#37319;?#30740;究疾病的本质难免带有一定局限性。许多病原体除人以外也能引起多种动物的感染,其症状体征表现可能不完全相同。但是通过对人畜?#19981;疾?#30340;比较,则可以充分认识同一病原体给不同机体带来的各种危害,使研究工作上升到立体的水平来揭示某种疾病的本质。
      因此,一个好的疾病模型应具有以下特点:①再?#20013;?#22909;,应再现所要研究的人类疾病,动物疾病表现应与人类疾病相似。②动物背景资料完整,生命周期满足实验需要。③复制率高。④专一性好,即一种方法只能复制出一种模型。应该指出,任何一种动物模型?#30142;?#33021;全部复制出人类疾病的所有表现,动物毕竟不是人体,模型实验只是一种间?#26377;?#30740;究,只可能在一个局部或一个方面与人类疾病相似。所以,模型实验结论的正确性是相对的,最终还必须在人体上得到验证。复制过程中一旦发现与人类疾病不同的现象,必须分析差异的性质和程度,找出异同点,以正确评估。
      四、人类疾病动物模型的分类
      1. 自发性动物模型(naturally occuring or spontaneous animal models)是取自动物自然发生的疾病,或由于基因突变的异常表现通过定向培育而保留下来的疾病模型。如大鼠的结肠腺癌、肝细胞癌模型,家犬的基底细胞癌、间质细胞癌模型等十余种。突变系的遗传性疾病很多,可分为代谢性疾病、分?#26377;?#30142;病、特种蛋白合成异常性疾病等。这类疾病的发生在一定程度上减少了人为因素,更接近于人类疾病,因此近年来十?#31181;?#35270;对自发性动物疾病模型的开发。
      2. 诱发性动物模型(experimental artificial or induced animal models)
      诱发性动物模型是通过物理、生物、化学等致病因素的作用,人为诱发出的具有类似人类疾病特征的动物模型。
      诱发性动物模型制作方法简便,实验条件容易控制,重复性好,在短时间内可诱导出大量疾病模型,广泛用于药物筛选、毒理、传染病、肿瘤、病理机制的研究。但诱发性动物模型是通过人为限定方式而产生的,多数情况下与临床所见自然发生的疾病有一定差异,况且许多人类疾病目前还不能用人工诱发的方法复制,因而又有一定的局限性。

    第二节 自发性人类疾病动物模型
    一、免疫?#27605;?#21160;物疾病模型
      1. B淋巴细胞?#27605;?#30142;病模型 临床常表现为免疫球蛋白缺失, 细胞免疫正常。 如CBA/N小鼠,起源于CBA/H品系,为X-染色体隐性遗传,其基因符号为xid。纯和型雌鼠(xid/xid)和杂合型雄鼠(xid/y)对Ⅱ型抗原(非胸腺依赖性抗原)以及双链DNA 等没有反应。对胸腺依赖性抗原缺乏抗体反应,IgG3、IgM低下。如果移植正常鼠的骨髓到xid宿主,B细胞缺失可得到?#25351;础?#32780;将xid鼠的骨髓移植到受射线照射的同系正常宿主,其仍然表现为不正常的表型。
      2. T淋巴细胞?#27605;?#21160;物疾病模型 胸腺分泌淋巴细胞?#27605;?#23548;致细胞免疫功能丧失,临床表现为毛发缺乏和胸腺发育不全。1966年在苏格兰的一群小鼠中发现了一种突变种--自发无毛小鼠,该鼠生长不良,繁殖力低下,易发生?#29616;?#24863;染,到1968年对无毛小鼠进行纵膈连续切片,显示出胸腺缺失,遗传检查为常染色体隐性遗传,这种动物能接受同种或异种组织移?#30149;?#29616;在有多种遗传性无胸腺动物,如裸小鼠、裸大鼠、裸豚鼠和遗传性无脾症小鼠动物模型。
      3. T、B淋巴细胞联合免疫?#27605;?#21160;物疾病模型 这是最?#29616;?#30340;免疫?#27605;?#30142;病,动物临床表现为低?#20204;?#34507;白血症、低淋巴细胞血症,由于B淋巴细胞缺乏, 在淋巴结内生发中心消失,由于T淋巴细胞缺乏,在脾动脉周围细胞鞘和淋巴结副皮?#26159;?#32553;小、淋巴细胞减少。SCID(severe combind immuno deficiency)小鼠由美国Bosma M.J于1980 年首次发现,1988年由Jackson实验室引入我国。遗传检查为第16号染色体上隐性突变基因,为C、B17/Icrj同源近交系。
      二、遗传性高血压大鼠疾病模型
      自发性高血压(SHR)是1963年在日本?#31579;员?#21644;Aoki从Wistar大鼠中筛选培育而成,血压呈?#20013;?#21319;高,雄性SHR还拌有广泛结节性动脉周围炎,被用作结节性动脉周围炎动物模型。用遗传育种法已纯化了八个品系遗传性高血压大鼠,即遗传性高血压品系(SHRSP)、盐敏感品系(DS)、自发性高血压品系(SHR)、中风型高血压品系(SHRSP)、Milan 高血压品系(MNS)、Munster品系(SHM)、Sabra高血压品系(SBH)和Lyon高血压品系(LH),病理生理及组织病理学变化与人类高血压疾病有相似之处。
      三、自发肿瘤疾病动物模型
      几乎所有人类肿瘤疾病在实验动物中都可以有相似的肿瘤疾病,肿瘤在不同种系动物中发病率有差异,利用高发病率品系动物来研究自发性肿瘤疾病,更接近人群发病情况。小鼠乳腺癌在C3H、A/He、DBA/1、DBA/2发病?#24335;?#39640;,在C3H雌性动物年龄超过9个月后,乳腺肿瘤发病率?#31579;?#36798;100%;肺肿瘤多在A/He、A/JAX,皮肤肿瘤在C57L/He、BR/cd,肝脏肿瘤在C3H、C3Hf、C3He、C57,淋巴网状系统肿瘤在C58、C57L,血管内皮瘤在HK、BALB/c等发病?#24335;?#39640;,在实际工作中应进行针对性选择。

    第三节 诱发性动物模型的复?#21697;?#27861;

      诱发性动物模型的复制不外是以生物的、物理的及化学的因素作用于动物,使动物产生类似于人类疾病的生理改变。
      物理因素包括机械力、温度和压力的改变、放射线 、噪音等。复制模型时要注意选择?#23460;?#30340;刺激强?#21462;?#26102;间和频率。例如要观察Ⅰ度烧伤,若作用时间过长,温度过高,则会出现深度烧伤,达不到观察Ⅰ度烧伤所引起的病理生理改变的目的,模型将失去价值。
      生物因素,如病毒、细菌、真菌、寄生虫、生物制品、细胞、毒素等各种致病原,通过注射或接种使动物产生相应疾病。用该方法进行复制时首先要注意易感动物与人临床症状的异同处,选用易感动物。如?#32959;?#30149;?#31350;?#24341;起婴儿急性坏死性肠炎,而犬感染该病毒后仅出现亚临床症状。人畜?#19981;疾?#21160;物模型是研究人类疾病的极好材料,现有 150多种人畜?#19981;疾?#36164;料,为流行病学、病理学和临床症状学的研究提供了依据。
      化学因素的作用有两方面,一是通过化学物质的烧伤、腐蚀,二是通过化学物质参与代谢实现的。在复制过程中要注意不同品种、不同年龄、体重的动物存在着剂量、耐药性和副作用的差异。如用四氯化碳复制肝脂肪变性动物模型,量过大会引起?#20301;?#27515;,乃至出现急性中毒而死亡,因此,在试验前要摸出稳定的实验条件。
      一、心血管系统疾病动物模型
      (一)心肌缺血的动物模型                        
      急性心肌缺血动物模型的制备方法很多,可概括分为两类,一是开胸法诸如冠脉结扎法、冠脉夹闭法、微量直流电刺激法、化学灼烧法及冠脉局部滴敷药物法?#27426;?#26159;闭胸法,通过注射或接种使动物产生相应疾病。包括异物法如微珠?#27695;?#27861;和球囊?#27695;?#27861;及冠脉内注射药物诱发冠脉痉挛法。开胸法直观省时,易掌握,冠脉病变的部位恒定,个体间差异小,但需行开胸手术并要求以呼吸机辅助呼吸,创伤大,动物死亡率高达30-60%。闭胸法简便易行,手术创伤小,动物死亡?#23454;停?#26415;后动物?#25351;?#36805;速,可以选择任何一支冠脉,定位准确,且动物处于较少的生理扰乱下,用这种方法制备的模型进行实验研究,结果相对准确,误差小。
      齐淑英等利用铜圈置入法制备急性心肌缺血动物模型,其机理可能在于铜圈作为异物被置入冠脉内,会诱发冠脉内血栓形成,?#27695;?#20896;脉而发生急性心肌缺血。选健康杂种犬,体重19±4kg,硫喷妥钠10mg/kg静脉注射麻醉动物,左侧卧位固定于实验台上。右颈部常规备皮消毒,横行切开皮肤,逐层分离皮下组织,暴露?#20063;?#39048;总动脉,结扎其远心端,近心端剪开?#26412;对?/2,送入8F动脉穿刺器,X线下沿穿刺器送入7F 预塑形左冠脉主干,注射38%泛影葡胺显影证实后,沿导管送入PTCA长导丝至左前降支远端, 撤出导管、将自制铜圈(用?#26412;?.2mm铜丝,以12-16号注射针头绕制7圈而成)?#33258;?#23548;丝上,再用PTCA导管将铜圈推送至左前降支第一分叉处,撤出导管(PTCA导管)及长导丝,铜圈留于局部,连续心电监护,间断注射造影剂。在实验中,于送入导管前静脉给予肝素钠1.5mg/kg,置铜圈前静注利多卡因2.0mg/kg,?#32531;?#32500;持静滴(1.0mg/min)。
      其结果,犬于放置铜圈后4-12min出现急性心肌缺血,冠脉造影显示铜圈远端不显影,心电图出现定位的ST-T改变,成功率100%。犬于实验结束后12h内均存活,死亡率为0。
    (二)动脉粥样硬化动物模型
      除田鼠和地鼠外,一般温血动物只要方法?#23454;?#37117;能形成动脉粥样硬化的斑块病变。常选用兔、猪、大鼠、鸡、鸽、猴和犬等动物。常用的复?#21697;?#27861;有高胆固?#32908;?#39640;脂肪饲料喂养法,免疫学方法,儿茶?#24433;?#31867;药物注射法,同型半胱氨酸注射法,幼乳大?#36164;?#27861;及胆固醇-脂肪乳剂静脉注射法等。
      家兔是使用最广的动物,它对造病膳食的敏?#34892;?#39640;,容?#33258;?#25104;高胆固醇血症与动脉粥样硬化。缺点为家兔的脂质代谢与人类不同,病变的解剖分布以胸动?#37995;?#20027;,小动脉常有病变;病理组织以血源性巨?#19978;?#32990;吞噬脂质为主,形成泡沫细胞,不容易形成粥样斑块,亦难以形成复合性病变;网状内皮系统常伴有脂质沉积。
      在含黄豆粉10%、麦粉38%、麸皮50%,盐1%及鱼粉1%的基础饲料中加进猪油与蛋?#21697;郟?#27599;天每?#24739;?#20820;喂基础饲料30-50g、猪油1.5g和蛋?#21697;?g。以上述造病膳食饲喂14周。在喂食后2周内,血浆胆固醇浓度从实验前的124mg/100ml逐渐上升,第8周达到最高水平,平均值为543mg/100ml。继后胆固醇浓度明显下降,停喂造病膳食后,下降更为明显,降至180mg/100ml。主动脉病变Ⅱ-Ⅳ级者达92%,其中Ⅲ-Ⅳ级病变占62%;病变虽以细胞内外脂质沉积为主,但网状内皮系统的脂质沉淀及肝脏损伤明显减轻,死亡?#24335;?#20302;。以该方法复制的动脉粥样硬化模型,比较符合人类的饮?#22478;?#20917;,实验中动物健康状态稳定,死亡?#24335;系汀?BR>  二、消化系统动物模型
      (一)肝硬化动物模型
      选体重150-200g的Wistar大鼠,将D-氨基半乳糖配制成10%的生理盐水溶液,用1NNaOH将pH调节至7.0,以250mg/kg的剂量行腹内注射,每天一?#21361;?#27599;周?#30701;歟及?#24180;左右即可形成肝硬化。
      在复制过程中,自股动脉取血作肝功能试验,包括血清蛋白测定、浊度试验、转氨酶、乳酸?#20122;?#37238;(LDH)、单?#36153;?#21270;酶(MAO)、5‘-?#22609;?#37240;酶(5‘-NA)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)及胆硷酯酶。分批处死动物进行尸解,观察腹水,心、肝、脾、肺肾等器官形态,用4%甲醛溶液固定,石蜡包埋,切片厚5微米,进行HE、网状纤维(Gordon与Sweet法)、胶原纤维(Van Gieson 法)及弹力纤维(Weiger法)染色。
      在采用上述剂量D-氨基半乳糖长期多次注入大鼠?#39592;?#26102;,动物耐受性较好。逐渐出现进食活动减少,有时解稀糖大便,腹部较为膨隆。半年内与对照组相比,实验组体重平均增长显著延缓。
      尸检时可见?#39592;?#20869;有腹水,0-20ml不等。心、脾、肺、肾、无明显改变。与对照组相比,早期肝明显增大、重量增加,色泽较?#19968;疲?#20197;后体积逐渐缩小,?#23454;?#21464;硬,边?#21040;?#38045;,肝表面可见?#33268;?#24615;分布的细颗粒状结节,结节大小不一,?#26412;对?#20026;0.5-1.5mm,结节间可见?#33268;?#20998;布的纤维间隔,间隔一般较?#24863;。?#20854;凹凸程?#20154;?#30149;变而加深。切片HE染色、光镜?#24405;?#26597;,在注射氨基半乳糖5个月后,肝小叶结构开始紊乱,形成大小不等的肝细胞团,有的仍见好的中央静脉,但其周围门脉区胆管上皮高度增生,其间夹有残留的个别肝细胞及少量单核多核白细胞及褐色素沉着。随着病程的延长,增生的胆管及纤维母细胞向四周呈星芒状伸展,有的与中央静脉相连。一般肝细胞变性坏死少见,大多呈增生表现。Gordon与Sweet 法染色显示肝细胞团?#22411;?#29366;纤维少见而周围组织中存在着大量疏松的网状纤维。胶原纤维及弹性纤维均未见增多。除肝外,其余实质器官切片无异常发现。
      实验动物在出?#25351;?#30828;化时血清白蛋白含量稍有降低,浊度试验略增高,血清GPT、LDH、MAO、5‘-NA、γ-GT与胆硷脂酶均无明显改变。
    (二)动物大肠癌模型
      动物大肠癌的自然发病率很低,仅田鼠较易发生大肠息肉和肿瘤。早期使用诱癌的化学剂多是芳香胺类,1965年Laqueur应用苏铁素(cycasin)及其配基-甲基偶氮氧?#29366;?MAM)成功地诱发了大鼠大肠癌,之后,又合成一系列类似物。目前用?#26434;?#21457;大肠癌的致癌剂主要是间接致癌剂二甲阱及直接致癌剂亚硝胺类。选用的动物?#34892;?#40736;、大鼠及豚鼠等。这里重点介绍二甲阱诱发小鼠大肠癌的方法。  
      选体重为18-20g的雌性昆明种小鼠,饲以常规饲料,任意饮水。致癌剂:对称的二甲肼(symmetrical 1,1-dimethylhydrazine,DMH),为白色粉状结晶, ?#30475;?#20020;注射前以无菌生理盐水配成0.4%溶液,并用NaHCO3将其pH调至6.5-7.0。每周给小鼠颈?#31185;?#19979;注射DMH 20mg/kg(即0.4%DMH溶液0.05ml/10g)一?#21361;?连续20(或16)次。 于注射日起6(或5) 个月末处死动物,检查大肠的肿瘤。
      据资料报导,大肠癌的发病率为81-100%。诱发的大肠肿瘤均系恶性肿瘤。肿瘤发生在肠壁的粘膜面,大多向肠内突出,肿瘤表面光滑,少数有糜烂。全部肿瘤均分布在距肛门6.5cm?#27573;?#20869;,以距肛门3-4cm处最密集。肿瘤的组织学检查,绝大多数为腺癌。实验中还诱发了一定量的肛门肿瘤,切片检查均为鳞癌。亦可用C57BL 纯系小鼠诱癌,方法同上,但诱癌?#23454;停?#20165;35%,每鼠带瘤数亦少,?#24471;?#27492;系小鼠对DMN不敏感。用DMH诱癌法,小鼠较大鼠合适,因为前者主要诱发大肠癌,后者除诱发出大肠癌外,小肠癌发病?#24335;?#39640;,?#24471;?#22823;鼠大肠组织对DMH敏?#34892;?#19981;如小鼠高。此外诱癌率与小鼠的种系亦有关系,一般认为C57BL纯系小鼠诱癌?#23454;汀?BR>  注射DMH及处理小鼠、垫料时需戴手套。加强防护措施。
      三、呼吸系统疾病动物模型的复制
      急性呼吸窘迫综合征(RDS)
      关于该模型复?#21697;?#27861;,除国内外多数采用的?#36864;?#27861;外,尚有静脉注射致死量大肠?#21496;?#20869;毒素、出血性休克、高浓度氧吸入等等。但目前认为用?#36864;?#27861;制备RDS 模型比较理想,因为这种模型的病理形态及病理生理的改变和临床所见者甚为相似,具?#24515;?#20123;临床RDS的特点,可以?#37995;?#20020;床研究的对象。从病理上说,注射?#36864;?#19982;临床诱发RDS的因素差异较大;诱发RDS的因素多种多样,表现在肺并无特异性,且本法变化迅速,典型,简便易行,故不失为一种较理想的方法。
      ?#36864;?#26159;一种毒性很强的脂肪酸,注入后首先通过神经、体液因素使肺微血管强烈收缩。随后,由于脂肪栓子阻塞肺毛细血管,造成肺微循环障碍;?#36864;?#23578;可直接刺激血管,损?#25628;?#31649;内皮细胞及肺泡上皮,增加通透性,导?#24405;?#36136;水肿,出血等病理改变。还有人指出,?#36864;?#26377;破坏肺泡表面活性物质的作用。
      取体重2-3kg的家兔,将动物背位固定于实验台上,在2%普鲁卡因局部麻醉下分离一侧颈总动脉?#21592;?#21462;血用。待动物安静后观察其一般状态,着重观察呼吸运动、舌粘膜颜色,并记录呼吸频率。由颈总动脉取血1ml(注射针管预先用20mg%肝素盐水冲洗),用丹麦radiomete微量血气分析仪测定PaO2、PCO2、 pH,并计算肺泡-动脉氧分?#20849;睿ˋ-aDO2)。用结?#21496;?#32032;注射器从耳缘静脉注射?#36864;幔?#21270;学纯,分子量282.47), 剂量为0.08ml/kg。注射后除观察呼吸频率、呼吸运动等一般变化外,分别于30、60、90、120?#31181;?#26102;取血1ml,重复测定血气及A-aDO2变化,与注射?#36864;?#21069;相比较。注射?#36864;?#21518;3小时将动物放血处死,开胸取?#21361;?#29992;生理盐水冲洗其表面血液,并用滤纸吸去表面水分,?#32531;?#22312;普通药物天平上称重,计算肺系数。肉眼观察肺组织大体变化后,将标本用10%中性福尔马林固定液固定,按常规作病理切片镜检。
      所有实验动物注射?#36864;?#21069;呼吸频率在40-60次/?#31181;?#38388;,注入?#36864;?#21518;10?#31181;?#24038;?#26131;?#24555;,可达140/分;2小时后?#21592;?#25345;呼吸过速,但已有减慢趋势。此外动物有明显吸气性呼吸困难,有的在60?#31181;幼员?#33108;溢出淡红色泡沫样液体,类似临?#24067;?#24615;肺水肿。
      注射?#36864;?#21518;血气突出变化是PaO2明显下降,60-120?#31181;?#26102;PaO2比开始下降 30mmHg左右。PCO2与pH值变化不大,但在实验过程中一般可看到初期PCO2 值偏低,pH值偏高,后期则相反,可能与机体代谢情况及呼吸频?#26102;?#21270;有关。
      注射?#36864;?#21518;肺泡与动脉分?#20849;?#26126;显加大。A-aDO2正常值在吸空气条件下为100mmHg,差?#23548;?#22823;提示肺泡氧?#33268;?#20837;动脉血发生障碍,是诊断RDS的重要依据。RDS时因肺水肿、充血、出血等影响通气与血流灌注比率,增加了无效灌注,导致重低氧血症,这种情况不能单纯用提高吸入氧?#36136;?FiO2 )纠正。
      A-aDO2计算公式:
                                      动脉血PCO2
    A - aDO2 =?#29627;?#22823;气压-水蒸气压)× 吸入气氧浓度- ──────〕- PaO2 =
                                      呼吸商    
                      40
      ?#29627;?60-47)× 0.21 - ──〕- PaO2 = 98 - PaO2
                      0.8
      家兔正常组织?#23454;?#32418;色,表面光滑,实验兔肺组织呈暗褐色,有点状或片状出血、小灶性坏死,多数动物气管内有粉红色泡沫样液体,肺体积增大。曾测定20例实验兔肺系数,平均值为10.41±2.94,明显大于正常值(4-5),提示有显著肺水肿。
                          肺重量(g)
                    肺系数=──────        
                          体重(kg)
    镜检可见部分肺泡呈代偿性扩张,部分肺泡萎陷显示局部不张,肺泡内有水肿液及出血,偶可见?#22411;该?#33180;形成。
      应注意必须保证?#36864;?#20934;确注入于血管内,因?#36864;?#24635;量甚微,如?#26434;型?#28322;则影响很大。处死动物以放血为好。取肺时应将心肺提起,结扎并离断腔静脉及主动脉,并于气管分叉上1mm处再结扎一线,从上端剪断气管,最后连同心肺血管全部结扎离断,务求准确得出肺重量。如此模型作实验治疗用,则?#31579;?#25454;实验要求延长动物存活时间或调整?#36864;?#21058;量。
      四、神经系统疾病模型
      实验?#21592;?#24577;反应性?#32422;?#39635;炎
      实验?#21592;?#24577;反应性?#32422;?#39635;炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE) 是一典型的实验模型。早在1944年Ferraro根据对一系列实验结果的总结,指出EAE和人的脱髓鞘病有相似之处。1947年Freund等报告,以脑或脊髓加Freund佐剂(FA) 进行免疫,仅需一次注射就能引起豚鼠EAE,而且成功率相当高。以后,以兔、小鼠、大鼠、 羊、猫、田鼠及猴等动物用同样方法均能复制成功,以豚鼠最为敏感。这里介绍用同种脊髓加FA进行免疫复制EAE的方法。
      Freund氏左剂的制备参照Paterson的?#21697;?液体石腊(c.p)8.5ml,无水羊毛脂(c.p)1.5ml,结?#21496;?#29992;上述混合液配成4mg/ml的FA。高压灭菌后使用。
      脊髓组织悬液:于实验当时,在无菌条件下先将豚鼠肝素化,?#32531;?#32463;胸主动脉用生理盐水灌洗至无血。取出脊髓,除去脊膜,称重,用玻璃研磨器将脊髓研成匀浆,以生理盐水配制成50%悬液。
      脊髓-FA乳剂的制备:将脊髓组织悬液与FA按1:1混合,用注射器反复抽注,即成乳剂。
      选用体重400g左右的豚鼠,于豚鼠的四个足掌肉垫各注射脊髓-FA 0.1ml, 每只豚鼠共注射0.4ml。注射后按常规饲养。
      免疫注射半月后,血清中逐渐出现抗脊髓抗体,皮肤试验呈延缓反应,而且豚鼠陆续出现后肢?#34987;荊?#29978;至大小便失禁,很易死亡。
      血清补体结合反应:由豚鼠心脏抽血,以3,000转/分离心30?#31181;?#20998;离血清。 抗原为1%脊髓生理盐水悬液,也经3,000转/分离心1小时,取其上清液作试验用。补体为2应用单位,溶血系统为2%绵羊红细胞及2单位的溶血素。
      皮肤试验:将豚鼠背部剃毛,用10%同种脊髓生理盐水悬液0.1ml作皮内注射, 注后当时及24、48小时观察皮肤反应。本实验在注后当时不见皮肤反应,而在24小时出现红斑或硬结,48小时仍存在,所以是延缓型反应。
      组织学检查:在实验终了?#36125;?#27515;动物,取出脑及脊髓等欲检查的脏器,福尔马林固定,常规切片、染色作镜检。可见脊膜及中央管周围有明显的淋巴样组织浸润、增厚,脊髓白质内有细胞浸润的小灶状病变及静脉周围呈套袖样浸润。神经细胞有坏死,细胞核消失呈匀质小体,或细胞体消失留下一空隙,以及细胞周围有圆细胞浸润等。在脑组织中可见到脑膜增厚,淋巴样细胞及单核细胞浸润。室管膜及脉络膜亦呈同样变化。小静脉及毛细血管周围,则呈套袖状细胞浸润。脑实质内?#34892;?#33014;质细胞组成的浸润灶。?#34892;?#26143;状细胞呈核碎?#36873;?#32990;浆苍白、细胞变形等。上述变化以脊髓的病理改变和?#34987;?#26368;为一致,是最特异的变化,仅见于注射脊髓加FA引起?#34987;?#30340;动物。血清抗体虽也有特异性,但与?#34987;?#25110;脊髓病变的程?#20219;?#19968;致性关系?#27426;?#30382;肤反应则既有特异性,又与?#34987;?#21450;脊髓病变呈一致性。文献报导还曾指出,这种模型不能用血清抗体进行传递,但用淋巴细胞被动传递则能成功。提示病变的本质属于细胞免疫机制。至于脑内的变化,特异性较差,用FA或其它组织悬液加FA注射的动物也能发现,唯程度轻的多,可能是FA本身引起的,?#37096;?#33021;因为其它组织和?#32422;?#28082;之间?#24515;?#20123;共同抗原性,从而引起交叉反应之?#30465;?BR>  五、泌尿系统疾病模型
    肾小球肾炎疾病模型
      在动物身上建立肾小球肾炎的方法很多,最常用的是通过免疫手段,主要采用的实验动物有大鼠、兔及狗。
      以生理盐水配制1:10及1:5鸡蛋?#20934;?#20026;抗原。用兔制备抗血清,选体重2kg左右的兔,第一次用1:10鸡蛋白1ml加FA1ml作成的乳剂注射于肌肉内,以后每周?#39592;?#27880;射一次1:10鸡蛋白2ml,不?#24188;?#21058;,共注射8次。最后一次注射后5天,心脏穿刺抽血,3000转/分离心30?#31181;櫻?#24471;血清作沉淀反应。如抗体滴度高就可采血,将血清在56℃灭活30?#31181;?#21518;备用。
      于上述血清中加入4倍量1:5-1:10鸡蛋白,?#21592;?#35777;抗原处于稍过剩状态, 将溶液混匀即可。  
      选用体重2kg左右的兔,在实验前4小时,给实验用的健?#20302;?#38745;脉注射1%台盼蓝10ml,以封闭网状内皮系?#24120;?#23454;验时由静脉注射上述抗原抗体复合物10ml,注射速度要慢。
      注射后2小时,肾脏就开始出现病变,其程?#20154;?#30528;时间的推移而逐渐明显。可在不同时间收集动物尿液、血液等进行各种检查。以后将动物处死, 取出肾脏作组织学检查。尿液检查时可发现蛋白、白细胞、红细胞甚至管型,这些改变在注射后一天已经很明显。血中非蛋白氮、肌酐等的浓度也在注射后一天即明显升高。肾脏的组织学检查显示病变呈?#33268;?#24615;,两侧肾脏均受累。可以发现肾小球毛细血管充血、白细胞渗出,时间稍久者还有由于肾小球内细胞增生而出现肾小球细胞增多、小球体积增大等变化。?#34892;?#32958;小球囊内还可见红细胞、浆液和纤维性渗出物,?#29616;?#26102;血管内可有血栓形成。肾小管上皮细胞常有浊肿、玻璃样变等,管腔内含有从肾小球滤过的蛋白、红细胞、白细胞和脱落的上皮细胞,有时它们凝成管型。肾间质内常有不同程度的充血、水肿和少量淋巴细胞及中性粒细胞浸润。动物死亡大约发生在注射后4天或更晚,如能存活2-3天,一般就不致死亡,一周后病变可逐渐?#25351;础?BR>  影响本实验的因素主要是抗体的滴?#21462;?#25239;原和抗体的比例。抗体的滴度要高,抗原量又要比抗体稍多,以致形成的抗原抗体复合物是溶解性的。Dixon的经验指出,肾脏病变呈急性还是呈慢性,与抗体的量及抗原、抗体的相对量有直接关系。抗体量过剩易引起急性肾炎,而抗原抗体量相等时则易引起慢性肾炎。另外,在注射抗原抗体复合物前必须把网状内皮系统充分地封闭,否则就不易成功。如果在注射前用大剂量肝素,则能预防肾炎的发生。
      六、内分泌疾病模型
      缺碘性甲状腺肿
      地方性甲状腺肿除少数地区是由食物高碘和?#24405;?#29366;腺肿物质引起外,主要病因是缺碘。该模型复?#21697;?#27861;很多,如用人工配制的低碘饮食饲养动物及用硫尿类和某些?#21069;?#31867;药物?#31181;?#30002;状腺组织的过氧化酶以阻碍甲状腺合成。后一种方法?#24405;?#29366;腺肿的机制和低碘性甲状腺肿的发病机制相差很大,不能真实地表现人类甲状腺肿的病理演变,因此在使用上受到一定限制。这里介绍后一方法。
      选体重120-150g的Wistar大鼠,饲以含玉米粉46%、大米粉40%、黄豆粉10%、碳酸钙0.5%、氯化钠0.5%、以及少量维生素B粉的食物。此外每周两次饲以去离子水培养的麦芽或稻芽。其中粮食是购自?#29616;?#22320;方甲状腺肿病区,磨粉后120℃烘拷24 小时。氯化钠采用分析?#31185;?经750℃烘烤12小时后使用。自由饮用电阻值2000K Ω以上的去离子水。实验三天后尿碘含量显著减少,并随着实验时间的延长而?#27426;?#19979;降。?#24471;?#20302;碘饮食3天后大鼠即处于碘饥饿状态。
      与对照组相?#28909;?#30872;17天甲状腺未见肿大,但充血显著,呈暗红色外观。缺碘35天全部甲状腺都显著肿大,充血更明显。随着缺碘时间的延长,肿大加剧,但到了127 天虽然甲状腺肿大,局部充血却减轻。
      缺碘早期甲状腺细胞增生活跃,腺组织滤泡增多,腺上皮呈高柱状,并增生形成乳头突入滤泡腔中,滤泡腔内胶质变稀薄,PAS反应减弱。间质充血。过氧化酶联苯胺染色显示过氧化酶活性明显增强。缺碘127天后滤泡上皮高度降低, 含有乳头的滤泡数量减少,滤泡?#26412;对?#22823;,胶质含量增加,过氧化酶活性降低等显示甲状腺病理变化由增生性逐?#36739;?#33014;性甲状腺肿转化。
      T4值在缺碘35天以后明显降低并?#20013;?#32500;持?#36864;?#24179;。缺碘后甲状腺 131I吸收率显著增加且峰值提前,表明大鼠处于碘饥饿中。
      缺碘97天以前与对照组相比无差异。缺碘127天重量显著增加。
      垂体切片用AT-PAS-OG染色,显示在缺碘35 天后?#32479;中?#20986;现促甲状腺素细胞增生肥大,?#24471;?#22312;碘饥饿?#36125;?#20307;-甲状腺轴的活动加强。
      低碘动物应单?#28010;?#20859;并严格避免含碘药物污染饲养室器皿及空气。沿海地区饲养室的空气应考虑除碘处理。
      七、其它疾病的动物模型
      多器官功能衰竭(MOF)
      1. 新?#36848;?#40060;胆汁致大?#36164;驧OF
      (1)实验动物 大鼠,体重200-300g。
      (2)器材   ?#36848;?#40060;胆汁、?#32570;?#36716;氨酶药?#23567;?#32966;红素药?#23567;?#32908;酐药?#23567;?#23615;素氮药?#23567;?%戊巴比妥钠溶液、重氮试剂、重铬酸钾溶液、95%乙?#32908;H12 磷酸?#21361;?#27682;氧化钠缓冲液、苦?#31471;帷?#33976;馏水、尿素氮标准应用液Ⅱ、DAM-TSC液、酸混合液、0.4mol/L NaOH、2,4-二硝基苯肼液、丙酮酸钠标准液、蛋白沉淀剂。大鼠固定器、厚线手套、金属灌胃管、试管、离心管、0.1-10ml吸管、微量加样注射器、721分光光度计、恒温水浴箱、手术器械一套、血气分析仪。
      (3)步骤
      ①用标准吸管吸取?#36848;?#40060;胆汁1ml,按比重法测比重并换算成毫升数。
      ②分别于实验前48小时向?#36164;?#28748;胃380mg/100gb.w 的鲩鱼胆汁和向乙鼠灌以同容量的生理盐水。
      ③分别用1%戊巴比妥钠35mg/100gb.w进行?#39592;?#20869;麻醉,并固定于鼠台上。
      ④手术分离大鼠一侧颈总动脉,取血1ml做血气、 酸碱指标(注意肝素化和隔绝空气)。
      ⑤切开颈动脉,将切口对准洁净试管口,抬高鼠尾部,向试管接血6ml,用2000转/分离心15?#31181;櫻?#20998;离血清?#21592;?#26816;测SGPT、胆红素、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。
      ⑥解剖动物内脏,肉眼观察肝、肾、肺和肠胃的变化。必要时切一小块组织放福尔马林液固定,?#21592;?#30149;理切片检查。
      2、用内毒素?#24405;?#20820;MOF
      (1)实验动物 家兔,体重2-3kg。
      (2)实验器材 内毒素、3%戊巴比妥钠、多?#25216;?#24405;仪、兔固定台,其它同实验?#34180;?BR>  (3)步骤
      ①取甲乙兔两只,甲兔于耳缘静脉注入0.1%内毒素0.3mg/kgb.w,乙兔则注入同容量生理盐水作为对照。
      ②将甲乙两兔分别用3%戊巴比妥钠1ml/kgb.w作耳缘静脉注射,麻醉后固定于兔台,分别做气管插管、颈动脉插管,接传感器并连接多导生理记录仪。
      ③注内毒素或生理盐水后60?#31181;印?40?#31181;?#20998;别记录心率、血压、 呼吸和心电图,另取颈动脉血1ml(注意肝素化和隔绝空气),用血气分析仪检测血气?#36864;?#30897;指标。
      ④继续取动脉血6ml,2000转/分,15?#31181;?#31163;心分离血清,检测SGPT、胆红素、BUN 、Cr的变化。
      ⑤实验结束前用快速放血法处死家兔,游离气管和肺脏,取出全肺计算肺系数。肺系数=肺湿重(g)/动物体重(kg)。
    (来源: 来宝网 )


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