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    大鼠白介素8(IL-8)ELISA试剂盒使用说明书

    厦门慧嘉生物科技有限公司2010年1月3日 18:57 点击:962

    大鼠白介素8(IL-8)ELISA试剂盒使用说明书

    本试剂盒仅供体外研究使用!

    预期应用

    ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中白介素8(IL-8)含量。

     

    实验原理

    用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗IL-8抗体的微孔中?#26469;?#21152;入标本或标准品、生物素化的抗IL-8抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-8?#25910;?#30456;关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

     

    试剂盒组成及试剂配制

    1.        酶联板:一块(96孔)

    2.        标准品(冻干品):2瓶,?#31185;?#20020;用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为5,000 pg/ml,请先稀释至1,000 pg/ml,再做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)后,分别稀释为1,000 pg/ml500 pg/ml250 pg/ml125 pg/ml62.5 pg/ml31.2 pg/ml15.6 pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml,临用前15分钟内配制。如配制500 pg/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml1,000 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀?#32431;桑?#20854;余浓度以此类推。推。

    3.        样品稀释液1×20ml

    4.        检测稀释液A1×10ml

    5.        检测稀释液B1×10ml

    6.        检测溶液A1×120μl1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先计算好的?#30475;?#23454;验所需的总量配制(100μl/孔),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A990μl检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

    7.        检测溶液B1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A

    8.        底物溶液1×10ml/瓶。

    9.        浓洗涤液1×30ml/瓶,使用时?#31185;?#29992;蒸馏水稀释25倍。

    10.    终止液1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

    11.    覆膜5

    12.    使用说明书:1

     

    ?#21592;?#29289;品

    1.   酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热)

    2.   微量加液器及吸头,EP

    3.   蒸馏水或去离子水,全新滤纸

     

    标本的采集及保存

    1.        血清:全血标本请于室温放置2小时或4过?#36141;?#20110;1000 x g离心20分钟,取上清?#32431;?#26816;测,或将标本放于-20-80保存,但应避免反复冻融。

    2.        血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20-80保存,但应避免反复冻融。

    3.        细胞培养物上清或其它生物标本:请1000 x g离心20分钟,取上清?#32431;?#26816;测,或将标本放于-20-80保存,但应避免反复冻融。

    注:以上标本置4保存应小于1周,-20-80均应密封保存-20不应超过1个月,-80不应超过2个月;标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

     

    操作步骤

    实验开?#35760;埃?#21508;试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37溶解);试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀?#26412;?#37327;避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。

    1.        加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白?#20934;?#26679;品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加?#32454;?#25110;覆膜,37反应120分钟。为保证实验结果?#34892;?#24615;,?#30475;?#23454;验请使用新的标准品溶液。

    2.        弃去液体,甩干,不用洗涤。每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">检测溶液A工作液 100μl(在使用前一小时内配制),酶标板加?#32454;?#33180;, 37反应60分钟。

    3.        温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,?#30475;?#28024;泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干(?#37096;?#36731;拍将孔内液体拍干)。

    4.        每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100μl,酶标板加?#32454;?#33180;37反应60分钟。

    5.        温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,?#30475;?#28024;泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干(?#37096;?#36731;拍将孔内液体拍干)。

    6.        依序每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">底物溶液90μl,酶标板加?#32454;?#33180;37避光显色30分钟内,此?#27604;?#30524;可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,?#32431;?#32456;止)。

    7.        依序每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。

    8.        用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后立即进行检测。

     

    1.  试剂准备:所有试剂都必须在使用前达到室温,使用后请立即按照说明书要求保存试剂。  实验操作中请使用一次性的吸头,避免交叉污?#23613;?/span>

    2.   加样:加样或加试剂时,请注意在吸取标本 / 标准品,酶结合物或底物时,第一个孔与最后一个?#20934;?#26679;之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的预孵育时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)最?#27599;?#21046;在10分钟内,如标本数量多,推荐使用多道移液器加样。

    3.   孵育:为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加?#32454;?#25110;覆膜,?#21592;?#20813;液体蒸发;洗板后应尽快进行下步操作,任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应?#32454;?#36981;守给定的孵育时间和温度。

    4.   洗涤:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水,同时要消除板底残留的液体和手指印,避免影响最后的酶标仪读数。

    5.  试剂配制:Detection ADetection B在使用前请手甩几下或少时离心处理,以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用,并使用相应的稀释液配制,不能混淆。请精确配置标准品及工作液,尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时,一次不要小于10μl),?#21592;?#20813;由于不准确稀释而造成的浓度误差;请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

    6.  反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如,每隔10分钟),如颜色较深,请提前加入终止液终止反应,避免反应过?#30475;?#32780;影响酶标仪光密度读数。

    7.  底物:底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射。

        建议检测样品?#26412;?#35774;双孔测定,?#21592;?#35777;检测结果的准确性。

        如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。

     

    洗板方法

    1.  手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫?#35206;?#21560;水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过程数次。

    2.  自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

     

    特异性

        本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠IL-8且与其它相关蛋白无交叉反应。

     

    计算

      ?#21592;?#20934;物的浓度为纵坐标(对数坐标),OD值为横坐标(对数坐标),在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析,如curve expert 1.3,根据样品的OD?#28068;?#26631;准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,?#27425;?#26679;品的实际浓度。

     

    检测范围:15.6 pg/ml - 1,000 pg/ml

     

    最低检测限3.9 pg/ml

     

    说明

    1.         在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染,试剂避免受到微生物的污染,因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

    2.         试剂盒保存:短期(1周以内)?#21592;?#31614;上的标示为准,长期保存请将试剂全部保存于-20



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