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    质粒DNA 的大量提取和纯化

    来宝网2007年4月5日 22:16 点击:3735

    质粒DNA 的大量提取和纯化

    在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯?#21462;?#39640;浓度的质粒DNA,为此需要大量提取
    质粒DNA。大量提取的质粒DNA 一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
    (一)、碱法
    1、取培养至对数生长后期的含pBS 质粒的细菌培养液250ml,4℃下5000g 离心15 分钟,弃上
    清,将离心管倒置使上清液全部流尽。
    2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml 用冰预冷的STE 中(此步可省略)。
    3、同步骤1 方法离心以收集细菌细胞。
    4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml 溶液I 中,充?#20013;?#28014;菌体细胞。
    5、加入12ml 新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10 分
    钟。6、加9ml 用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15 分钟,此时应形成白色
    絮状沉淀。
    7、4℃下5000g 离心15 分钟。
    8、取上清液,加入50ml RNA 酶A(10mg/ml), 37℃水浴20 分钟。
    9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g 离心10 分钟。
    10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g 离心10 分钟。
    11、取上层水相,加入1/5 体积的4mol/L NaCl 和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60 分钟。
    12、4℃下12000g 离心15 分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤,4℃下12000g 离心5 分钟。
    13、真空抽干沉淀,溶于500ml TE 或水中。
    [注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。
    2. 加入溶液II 和溶液III 后操作应混和,切忌剧烈振荡。
    3. 由于RNA 酶A 中常存在有DNA 酶,利用RNA 酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行
    热处理(80℃ 1 小时),使DNA 酶失活。
    (二)、Wazard 大量DNA 纯化?#20302;?BR>碱法大量提取DNA 往往需要很长的时间.Promega 公司的Wiazrd 大量DNA 纯化?#20302;?#26082;简单又快
    速,只需要离心和真空抽干,这个?#20302;?#21487;以从500ml 培养液中在3 小时以内获得1mg 以上的高质量的
    质粒DNA(200-20000bp)。该?#20302;?#19981;需要酚和氯仿抽提,纯化后的DNA 溶于水或TE 缓冲液中,不含任
    何盐份,可以直接用于DNA 序列分析和酶切反应,?#37096;?#20197;用于在核酸酶抑制?#31890;?#22914;RNasin)存在的
    条件下进行体外转录反应?#21462;?BR>该?#20302;?#20013;含有的试剂和柱子可以用于10 次100-500ml 质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细
    胞悬浮液,150ml 细胞裂解液,150ml 中和液,100ml Wizard 大量DNA 纯化树脂,125ml Wizard
    柱子洗脱溶液和10 支 Wizard 带有存储离心管的柱子。
    1、100-500ml 细胞培养液置离心管中, 22-25℃下5000g 离心10 分钟, 所得细胞沉淀充?#20013;?#28014;
    于细胞悬浮液中。
    2、 加15ml 细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用?#34892;?#25391;荡,细胞裂解完全时,
    溶液会变清,这一步需要20 分钟。
    3、 加15ml 中和溶液,立即反复倒置离心管数次,并使之混?#21462;?BR>4、 14000g,22-25℃离心15 分钟。
    5、 小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。
    6、 加0.5 倍体积的异丙醇,混合均匀, 14000g 22-25℃下离心15 分钟。
    7、 弃上清,悬浮DNA 沉淀于2ml TE 缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。
    8、 加10ml Wizard 大量DNA 纯化树脂溶液, 并?#34892;?#28151;合。
    9、每一个样品,使用一支Wizard 大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega 产品,与此配套)。
    10、将树脂/DNA 混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA 混合液。
    11、将树脂/DNA 混合液抽干后,加13ml 柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA 进行洗
    脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液),并加入柱子中。
    12、真空抽干所加入的洗脱。
    13、 再加12ml 柱子洗脱液进柱子并抽干。
    14、 加入5ml 80%乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管
    中,2500rpm(1300g)离心5 分钟。
    15、 取出柱子,真空抽干5 分钟,再将柱子放入?#20302;?#20013;所提供的离心管中,2500rpm(1300g)离
    心5 分钟。
    16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE,1 分钟后2500rpm(1300g)离心柱子/离心管5 分钟。
    17、 取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中,盖?#32454;?#23376;,储存在4
    ℃或-20℃备用。
    [注意] 1. 在使用之前,?#20302;?#25152;提供的柱子洗脱液按1:1 加入125ml 95%乙醇。
    2. 纯化树脂必须混匀后再用.
    (三)、Sephrose 2B 柱纯化质粒DNA
    碱法提取的质粒DNA ?#35789;?#29992;RNA 酶处理,仍会含有少量RNA。当?#34892;?#35797;验需无RNA 污染的DNA
    制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B 或Sepharose 4B 进行纯化,该方法具有快速,
    条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA 纯化。
    1、将Sepharose 2B 经含0.1% SDS 的TE(pH8.0)平衡后上柱。
    2、将至多1ml 的DNA 溶液铺在Sepharase 2B 柱上。
    3、待DNA 溶?#21644;?#20840;进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS 的TE(pH8.0)贮液瓶。
    4、以1ml 流出液为1 份进行收集。
    5、对每一管测定其OD260 值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA 在柱上流出的第一
    个峰中。
    6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g 离心2 分钟,将上层水
    相转入新管。
    7、加入2 倍体积的冰冷无水乙醇,-20℃下沉淀10 分钟,然后4℃下12000g 离心10 分钟,弃去
    上清液。
    8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g 离心10 分钟,弃去上清液。
    9、 沉淀真空抽干,重?#27695;?#20110;TE 或无菌水中。
    [注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保?#21046;?#25972;。对新装成的柱,应用
    含0.1% SDS 的TE 平衡, 以使柱内的凝胶均?#21462;?BR>

    (来源: 来宝网 )


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