• <div id="y09gn"></div>
  • <li id="y09gn"></li>
    <dl id="y09gn"></dl>
    <div id="y09gn"><s id="y09gn"></s></div>
    来宝网Logo

    热门词:生物显微镜 水质分析仪 微波消解 荧光定量PCR 电化学工作站 生物安全柜

    现在位置首页>技术资料首页>实验技术>实验技术>血细胞分离技术

    血细胞分离技术

    来宝网2007年4月27日 22:08 点击:1370

    采血

    (一)材料与试剂

    1.抗凝剂
    (1)肝素:肝素是含硫酸基的粘多糖,常用其钠盐或钾盐,它能阻止凝血酶原转化为凝血酶,进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白,从而阻止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml,市售肝素多为100U~126U/mg。
    (2)乙二胺四乙酸(EDTA):是一种螯合剂。用生理盐水配制成4%的溶液备用。
    (3)阿氏液(Alsever液),配方如下:
      枸橼酸钠(Na3C6H5O7·5H2O)      0.80g
      枸橼酸                            0.0325g
      葡萄糖                            2.05g
      氯化钠                            0.42g
      H2O        加至                  100.00ml
    混匀溶解后,114.3℃高压蒸汽灭菌10min备用。
    阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂,又含有细胞生存的营养,所以它既可做抗凝剂,又可做血细胞的保存液。
    2.针头  根据不同动物和采血部位,采用不同型号的针头,用前必须灭菌或消毒。
    3.采血容器  注射器或三角瓶等。
    4.采血动物。
    (二)操作方法
    1.采血法  各种动物采血方法不一。马、牛、羊等大动物一般从?#26412;?#33033;采血,猪从?#26412;?#33033;、前腔静脉或耳静脉采血,?#20202;?#30001;翼下静脉或心脏采血,兔由心脏或耳静脉采血,犬由?#26412;?#33033;或四肢静脉采血,豚鼠由心脏采血,小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。
    2.抗凝  采集血液最关键的问题是抗凝,采用什么方法进行抗凝,则根据实验的要求和条件而定。最常用的方法如下:
    (1)肝素抗凝:采血?#20445;?#20351;每ml血液含15U~20U肝素即可。计算采集的血液量,按1 000U/ml的量加入肝素,直接放入采血容器中,采血?#20445;?#36793;采血边轻轻摇动,使抗凝剂和血液混匀。对于采少量的血液或小动物采血,可直接用注射器抽取一定量的肝素液,再采血直接抗凝。
    (2)EDTA抗凝:采血前,用灭菌生理盐水将EDTA配制成4%溶液,然后按预采血液的量,以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液体量于采血容器内。采血,并?#27426;?#25671;动采血容器,使之混匀。
    (3)玻璃珠法:预先将适量的玻璃珠(根据采血量多少而定)清洗后,装入采血容器中,灭菌后备用。采血过程中,边采边摇采血瓶,以使小玻璃珠在血液中滚动,以机械地除去纤维蛋白,使血液不能凝固。本法虽?#19979;櫸常?#20294;对淋巴细胞的活性影响最小,且可减少血小板的混杂。
    (4)阿氏液采血:以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液,边采边轻轻摇动采血瓶,使之混匀。用阿氏液采血,除了抗凝外,多用于红细胞的保存。一般在4℃条件下,阿氏液中保存的红细胞2周其活性和特性不变。

    红细胞的分离技术

    (一)材料与试剂

    1.肝素等抗凝剂
    2.3%明胶液  取明胶3g,溶于0.9%灭菌盐水100ml中,114.3℃灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存。临用?#20445;?7℃预热10min。
    3.阿氏液
    (二)操作方法
    1.采血抗凝,即为红细胞。由于红细胞与白细胞的比例相差悬殊,一般白细胞混杂在其中,忽略不计。
    2.根据红细胞的用途,可做进一步的处理。如计算红细胞,可直接稀释计数。如需做?#22266;?#32467;合?#20174;Γ?#25110;其它溶红细胞?#20174;Γ?#21017;需将红细胞进行充分的清洗,以除去附着在红细胞膜表面的血浆。一般用等渗的稀释液连续清洗,2 000r/min离心10min,重复3~4次。
    3.如需储藏备用,则以阿氏液做抗凝剂采血,混匀后置4℃冰箱保存,可保存2周,其活性尚可。
     
    淋巴细胞的分离技术
     
    (一)材料与试剂
        1.淋巴细胞分层液有两种:
     (1)聚蔗糖—泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成40±1%(W/V)水溶液,也有干粉出售。应用?#20445;?#29992;蒸馏水配制9%溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名Vrografin,结构式为3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1—去氧—?#35013;?#22522;山梨醇。含量为60%或75%,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影。应用?#20445;?#21462;60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺。
     
    1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制:
    9%聚蔗糖液                 24份
    33.9%泛影葡胺液            10份
    混合即可。必要?#20445;?#21487;测比重。需要备用,可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min,4℃保存。一般可保存3个月。
    如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算:
    式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重,V1和V2分别为它们的体积。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液,则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为100︰46.3。
    (2)泛影葡胺—右旋糖酐(dextran)液
      34%泛影葡胺液               10份
      60%右旋糖酐液               12.5份
    混合,即为比重1.07~1.09的分层液。分装于棕色瓶中,4℃冰箱保存备用。
    2. 3%的明胶液  称取明胶3g,溶于0.9%的灭菌生理盐水,终体积100ml,114.3℃高压灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存,临用时37℃预热10min。
    3.Hank’s液。
    (二)操作方法
    1.取抗凝血,自然?#20004;担?#22914;是马属动物的血液,可直?#21448;?#31435;试管架上,让其自然?#20004;?h,取上层血浆。如是牛、羊血液,由于其血?#20102;?#24230;非常慢,可加等量3%明胶液,混匀后让其自然?#20004;担?h后取上层血浆。
    2.2 000r/min离心10min,弃上清。
    3.沉淀用Hank’s液混悬后,再2 000r/min离心10min。
    4.重复步骤3一次,再用细胞营养液将白细胞制成悬液。此液含有整个白细胞群,包括粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和部分红细胞。可供白细胞计数用。
    5.取2ml细胞分层液于离心管内,同时用毛细吸管吸取约2ml的血浆(自然?#20004;?h的上层血浆)轻轻加入分层液上,直接加抗凝血?#37096;傘?BR>6.以水平转子离心机2 000r/min离心20min。离心后,可见分成多层,最下层是红细胞,中间层是分层液,最上层是血浆。在血浆层与分层液之间是一薄层?#29616;?#23494;的白色层,即为单个核细胞层。
    7.用毛细吸管插入到单个核细胞层并吸取该层,放入另一试管中。
    8.以Hank’s液洗涤、离心,最后配制成?#23454;?#30340;白细胞浓度。必要时可计数。
    (三)注意事项
    1.血浆或血液加入分层液中时要小心,缓慢不要打乱液层、不要摇动。?#37096;?#20197;将分层液加入到血浆的上层。
    2.保?#33267;?#24052;细胞的活性是非常重要的,所以一般情况下,是现采血,马上进行分离。
    3.经过分层液分离的淋巴细胞层,实际上是单个核细胞层,包括单核细胞,不包括粒细胞。欲分离出纯的淋巴细胞,则按下法除去单核细胞,或收获单核细胞。

    T淋巴细胞的分离技术

    (一)原理 
    混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱?#20445;珺细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘?#25509;?#23612;龙毛上,而多数T细胞则通过尼龙毛柱,这是获?#37238;?#21547;T细胞群的?#34892;?#26041;法。
    (二)材料及试剂
    1.尼龙毛(Femwall Laboratories,LP-1 Leukoqak leukocyte Filters)。
    2.烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。
    3.装填尼龙毛柱,一次性注射器。
    4.取自然?#20004;?#30340;上层血浆,过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后,获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。
    (三)操作方法
    1.尼龙毛的清洗与干燥
    (1)戴上已经洗去滑石粉的一次性手套,将尼龙毛(1包或2包,每包35g)放入烧杯中,加入蒸馏水或去离子水,用铝箔盖上烧杯并煮?#24615;?0min。
    (2)冷却至常温,倒入漏斗内,使水滴干。
    (3)重复(1)、(2)步骤6次。
    (4)将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内,37℃温箱干燥2~3天后,贮藏在带盖的方盘内。
    2.装尼龙毛柱
    (1)取50ml玻璃注射器,拔去注射芯,在注射器头上套一段带夹子的胶管。
    (2)将尼龙毛梳理,并?#23454;?#25240;叠,以适应注射器的?#26412;叮?#22635;入注射器内,约20ml的体积。
    (3)将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好,高压灭菌。
    3.细胞分离
    (1)将注射器固定在支架上,倒入37℃的细胞培养液,关闭阀门一定时间,然后打开阀门,放掉细胞培养液,以清洗?#22797;?#23612;龙毛,关上阀门。
    (2)将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成?#23454;?#30340;浓度,约5.00×107个细胞/ml。
    (3)将细胞液倒入注射器内,使之没过尼龙毛柱。盖上注射器,37℃温育45min
    至1h。
    (4)打开下口,缓慢放流(1滴/min),收集于离心管中。
    (5)离心,即获所需的T淋巴细胞。
    (6)关闭注射器下口,于注射器内加入0.85%冰冷生理盐水,振荡,并套上注射器芯,打开下口,使劲推出注射器内液体,即获得粘?#25509;?#23612;龙毛上的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。
    (四)注意事项
    1.此种分离法,T淋巴细胞也常有一部分被吸附,吸附的多少与尼龙毛的质量有关,与装柱的?#23665;?#20063;有关系。
    2.此法的T淋巴细胞的回收?#35797;?0%~30%。
    3.用过的尼龙毛可回收,以盐水洗涤,然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜,然后再同前法清洗。
     
    单核细胞分离技术
     
    (一)铁粉吸附法
    1.材料及试剂
    (1)铁粉或羰基铁粉(Atomergic chemetals)99%的纯度,颗粒小于60µm(Goodfellow Metals)。
    (2)?#30475;盘?#39532;蹄形)。
    (3)一块小棒状?#30424;?#32422;1cm长)。
    (4)毛细吸管等。
    2.操作方法
    (1)称取一定量的铁粉,一般为10g,用100ml生理盐水洗涤4次,去除任何可溶性有毒物质。在倒去盐水?#20445;?#29992;?#30475;盘?#21560;住铁粉。
    (2)用50ml生理盐水混悬铁粉。摇匀后,分装于10个瓶中,包扎瓶口,121℃灭菌20min,拿出后立即轻轻摇匀,防止铁粉结块,储藏备用。
    (3)临用前,倒去瓶中的生理盐水,加入适量的单个核细胞悬液(3ml~5ml,细胞总数为8×107个/瓶)。37℃温育45min,中间不时晃动,?#22266;?#31881;悬浮起来。
    (4)加入一块小?#30424;?#26834;于瓶中,让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的细胞。
    (5)倒出悬液,此悬液主要是淋巴细胞,离心,收集。
    (6)在铁粉瓶内倒入一定量的Hank’s液,用力振摇后,以?#30475;盘?#21560;附,几分钟后,倒出液体。
    (7)2 000r/min离心液体,管?#20934;?#20026;单核细胞。
    (二)玻璃板吸附法
    将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内,置37℃ 30 min~40min,用毛细吸管轻轻吸取悬液,即为淋巴细胞。用适量的Hank’s液冲洗平皿,收获即为单核细胞悬液。

     

     

    (来源: 来宝网 )


    全年征稿 / 资讯合作

    联?#28068;氏洌簁[email protected]

    版权与免责声明

    • 凡本网注明“来源:来宝网”的所有作品,版权均属于来宝网,转载请必须注明来宝网, http://www.67994619.com,违反者本网将追究相关法律责任。
    • 本网转载并注明自其它来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不?#26800;?#27492;类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载?#20445;?#24517;须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
    • 如涉?#30333;?#21697;内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为?#29260;?#30456;关权利。
    云南11选5技巧
  • <div id="y09gn"></div>
  • <li id="y09gn"></li>
    <dl id="y09gn"></dl>
    <div id="y09gn"><s id="y09gn"></s></div>
  • <div id="y09gn"></div>
  • <li id="y09gn"></li>
    <dl id="y09gn"></dl>
    <div id="y09gn"><s id="y09gn"></s></div>
    河北十一选五直选遗漏数据 360可以买彩票 32张小牌九游戏 香港最准两码中特 不收费幸运飞艇qq群 百家乐真人玩下载 排列三走势图连线 香港马会内部传真一波中特免费下载 五分彩定位胆规律 香港赛马会透码 龙江体彩61开奖结果 体彩22选5重号分布图 红宝石娱乐城博彩网站 快乐扑克3怎么购买 上海快三走势图开奖