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    蛋白质提取的方法总汇

    来宝网2007年4月4日 8:20 点击:1482

    1、植物组织蛋白质提取方法
    1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同?#23454;?#21152;入),准备提取液放在冰上。
    2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。
    3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
    4、提取上清夜,样品制备完成。
    蛋白质提取液:300ml
    1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml
    2、甘油(Glycerol)75ml
    3、聚乙烯?#37327;?#28919;酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
    这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳!
    2、植物组织蛋白质提取方法
    三氯醋酸—丙酮沉淀法
    1、在液氮中研磨叶片
    2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。
    3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用。
    4、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。
    5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。
    药品:
    提取液:含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
    裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
    这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!
    3组织:肠黏膜
    目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达
    应用TRIPURE提取蛋白质步骤:
    含蛋白质上清液中加入异丙醇?#28023;?.5ml每1mlTRIPURE用量)
    倒转混匀,置室温10min
    离心:12000 g,10min,4度,弃上清
    加入0.3M盐酸胍/95%乙醇?#28023;?ml每1mlTRIPURE用量)
    振荡,置室温20min
    离心: 7500g,5 min,4度,弃上清
    重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2次
    沉淀中加入100%乙醇 2ml
    充分振荡混匀,置室温20 min
    离心: 7500g,5min,4度,弃上清吹干沉淀
    1%SDS溶解沉淀
    离心:10000g,10min,4度
    取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)
    存在的问题:加入1%SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉定,SDS结晶?测浓度,含量才1mg/ml左?#25671;?/DIV>
    解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5-10分钟,效果很好的。
    4、植物材料:水稻苗,叶鞘,根
    1、200?#37327;?#26679;品置于冰上磨碎
    2、加lysis buffer,离心,10000rpm,4度,5min取上清
    3、重复离心5min
    lysis buffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
    5、蛋白质样品制备
    秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进?#23567;?/DIV>
    100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯?#37327;?#28919;酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM即0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20℃沉淀1小时,4℃,15000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
    按每mg干粉加入20μl(可调) UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃温育30min,期间搅动?#22797;危?8度 (温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳。或者-70度保存
    6、植物根中蛋白质的抽取
    (1) sample, 液氮研磨
    (2) 装1.5 ml centrifuge 用tube
    (3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
    (4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite
    (5) 取上层液,蛋白质就在里面
    (来源: 来宝网 )


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