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    人巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)ELISA试剂盒使用说明书

    厦门慧嘉生物科技有限公司2010年1月3日 18:59 点击:969

    巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)ELISA试剂盒使用说明书

    本试剂盒仅供体外研究使用                                    

    预期应用

    ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中MIP-2含量。

    实验原理

    用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗MIP-2抗体的微孔中?#26469;?#21152;入标本或标准品、生物素化的抗MIP-2抗体、HRP标记的亲?#36864;?/span>,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MIP-2?#25910;?#30456;关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

    试剂盒组成及试剂配制

    1.         酶联板:一块(96孔)

    2.         标准品(冻干品):2瓶,?#31185;?#20020;用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为20 ng/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释20 ng/ml10 ng/ml5 ng/ml2.5 ng/ml1.25 ng/ml0.625 ng/ml0.312 ng/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml,临用前15分钟内配制。

    如配制10 ng/ml标准品:取0.5ml 20 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀?#32431;桑?#20854;余浓度以此类推。

    3.         样品稀释液1×20ml/瓶。

    4.         检测稀释液A1×10ml/瓶。

    5.         检测稀释液B1×10ml/瓶。

    6.         检测溶液A1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先计算好的?#30475;?#23454;验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

    7.         检测溶液B1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A

    8.         底物溶液1×10ml/瓶。

    9.         浓洗涤液1×30ml/瓶,使用时?#31185;?#29992;蒸馏水稀释25倍。

    10.     终止液1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

    标本的采集及保存

    1.         血清:全血标本请于室温放置2小时或4过?#36141;?#20110;1000 x g离心20分钟,取上清?#32431;?#26816;测,或将标本放于-20-80保存,但应避免反复冻融。

    2.         血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

    3.         细胞培养物上清或其它生物标本:请1000 x g离心20分钟,取上清?#32431;?#26816;测,或将标本放于-20-80保存,但应避免反复冻融。

    注:以上标本置4℃保存应小于1周,-20℃或-80℃均应密封保存-20℃不应超过3个月,-80℃不应超过6个月;标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测;高血脂的标本不需进行特殊处理,可直接检测。

     

    操作步骤

    实验开?#35760;埃?#35831;提前配制好所有试剂;试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀?#26412;?#37327;避免起泡。?#30475;?#26816;测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,均应用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。建议各实验室在操作前先进?#24615;?#23454;验以建立最佳稀释倍数。

    1.         加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul余孔分别加标准品或待测样品100ul,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加?#32454;?#25110;覆膜,37反应120分钟。

    为保证实验结果?#34892;?#24615;,?#30475;?#23454;验请使用新的标准品溶液。

    2.         弃去液体,甩干,不用洗涤。每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">检测溶液A工作液 100ul(取1ul检测溶液A99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37,60分钟。

    3.         温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,?#30475;?#28024;泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干(?#37096;?#36731;拍将孔内液体拍干)。

    4.         每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100ul3760分钟。

    5.         温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,?#30475;?#28024;泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干(?#37096;?#36731;拍将孔内液体拍干)。

    6.         依序每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">底物溶液90ul37避光显色30分钟内,此?#27604;?#30524;可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,?#32431;?#32456;止)。

    7.         依序每?#20934;?b style="mso-bidi-font-weight: normal">终止溶液50ul,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。

    8.         用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后立即进行检测。

    1.         ?#30475;?#23454;验留一孔作为空白调零孔(不同于空白孔),该孔不加任何试剂,只?#20146;?#21518;加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

    2.         ?#32454;?#25353;?#23637;?#23450;的时间和温度进行温育?#21592;?#35777;准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温。使用后立即冷藏保存试剂。

    3.         洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入检测溶液B或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加?#32454;?#25110;覆膜,洗板拍干后请立即加入后步试剂,应避免微孔干燥掉。

    4.         消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。

    5.         在储存和温育时避免强光直接照射。

    6.         未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

    7.         建议检测样品?#26412;?#35774;双孔测定,?#21592;?#35777;检测结果的准确性。

     

    洗板方法
    手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫?#35206;?strong>

    纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需

    要,重复此过程数次。
    自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

    特异性

        本试剂盒可同时检测重组或天然的人MIP-2,且与其它相关蛋白无交叉反应。

    计算

      ?#21592;?#20934;物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线(推荐使用专业制作曲线软件进行分析,如curve expert 1.3),根据样品的OD?#28068;?#26631;准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,?#27425;?#26679;品的实际浓度。

    注意事项

    1.         洗涤过程?#27973;?#37325;要,不充分的洗涤?#33258;?#25104;假阳性。



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