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    红细胞血型抗体检测技术进展

    来宝网2007年4月6日 14:44 点击:3666

    红细胞血型抗体检测技术进展


    徐 华 刘 晟综述 刘孟黎 审校(作者单位:710061 陕西省西安市中心血站)



    【摘要?#20426;?#26412;文通过综述盐水介质凝集试验、胶体介质凝集试验、酶处理红细胞凝集试验、抗球蛋白试验、低离子凝聚胺试验和微管凝胶检测试验等检测红细胞血型抗体的技术方法, 认为微管凝胶检测试验技术将成为检测红细胞血型抗体的主流方法。
      
    由于红细胞血型抗体与溶血性输血反应、新生儿溶血病及器官移植后的免疫排斥反应等有着密切关系, 所以对红细胞血型抗体的检测越来越引起重视, 其检测技术也在?#27426;?#21457;展。国际输血协会( ISBT ) 在1999 年报告中称, 红细胞血型为:25 个血型?#20302;常?#26412;站按:现为29个血型?#20302;常?70 余种抗原[ 1 ] , 还有一些血型集合和血型系列。血型抗体主要以IgM、IgG 和IgA 等形式存在,由相应的血型抗原刺激产生,最常见的免疫途径是血型不合的输血和妊娠, 同种异体间的组织器官移?#30149;?#26681;据对红细胞的凝集反应,红细胞血型抗体可以分为: (1) 完全抗体。这些抗体能够在盐水介质中凝集相应的红细胞所以又称为盐水抗体,它们主要是分子量较大的IgM ;(2) 不完全抗体。这类抗体主要是分子量较小的IgG,虽然能够结合红细胞上的抗原,但在盐水介质中不能使红细胞凝集。根据这些抗体的特性,?#35270;?#30340;检测相应抗体的方法在?#27426;?#20135;生,?#27426;系?#25913;进和发展。

    1 盐水介质凝集试验 盐水介质凝集试验中的抗原是盐水红细胞悬液, 红细胞上的抗原决定簇与相应的抗体分子上的抗原结合部位结合,交叉连?#26377;?#25104;肉眼可见的凝集块。盐水介质凝集试验用于IgM抗体的检出、鉴定和盐水交叉配血试验以及通过盐水抗体鉴定的血型?#20302;常?如ABO、MN、P、S 等。盐水介质凝集试验在测定血型和交叉配血时, 采用离心后立即观察结果的方式,具有操作简便、省时和耗用低的优点。但由于在盐水介质里, 红细胞之间的距离约25 nm ,IgM 抗体分子上多数相邻两个Fab 端之间的最短距离大于35 nm ,而IgG 抗体分子两Fab 端的距离一般都小于25 nm,所以IgG抗体不能在盐水介质里与相应抗体的红细胞发生凝集,而IgM 抗体则能发生凝集。但是检测灵敏度低和对不完全抗体的低敏?#34892;?#20250;导致?#29616;?#21518;果, 同时还存在结果不稳定和不?#30528;?#35835;的缺点,因此该类方法已被淘汰或仅仅被用于血型相容性试验的初步试验。

    2 胶体介质凝集试验 IgG类抗体在盐水介质里通常不发生凝集,但如果用胶体介质配制红细胞悬液,红细胞上的抗体就可以与血清中相应的IgG抗体发生凝集,胶体介质影响了凝集反应过程的第二阶段。红细胞表面有丰富的唾液酸,在中性环境里红细胞带负电荷。由于带有相同的电荷,互相排斥?#24066;?#28014;状态。静电理论认为细胞表面的电荷愈多,介?#23454;?#20171;电常数愈小,动电位就愈大,红细胞间的质力就愈大,细胞间的距离就愈大 ;反之,红细胞间的距离就小。胶体介?#23454;?#20027;要作用是提高介电常数,缩短红细胞之间的距离,使IgG抗体致敏的红细胞呈现凝集现象。用以构成胶体介?#23454;?#29289;质?#20449;?#34880;清白蛋白(BSA )、人白蛋白、AB 型血清、阿拉伯树胶等,以AB 型血清取材最为方便,牛白蛋白效果最好,使用也较多。胶体介质凝集试验提高了反应的灵敏度, 尤其是对IgG 类抗体。但这类方法的操作复杂, 试验要求也?#32454;擼?同样存在判读主观性大的问题。目?#25353;?#31867;方法采用?#27426;啵?#22312;美国 大约只有21% 的实验室使用某些牛血清白蛋白制成的促进抗体作用的溶液: 其中18% 使用22% 的BSA ,仅有3% 使用30% 的BSA [ 2 ]。其它一些方法通过使用低离子浓?#28909;?#28082;(LISS)、添加了高分子物?#23454;腖 ISS 或聚乙烯乙二醇(PEG) 等来中和红细胞表面的负电荷, 缩短红细胞之间的距离以增强直接凝集反应。

    3 酶处理红细胞的凝集试验 红细胞表面有丰富的唾液酸, 使之在中性环境里带负电荷, 这也是红细胞互相排斥的原因。蛋白水解酶能消化破坏这种唾液酸, 减少红细胞表面的负电荷, 从而促进凝集。常用酶有菠萝酶、木瓜酶等。酶法可分为一步法和二步法, 一步法不如二步法敏?#26657;?#20294;操作简便,用于交叉配血时比较方便 ?#27426;?#27493;法一般用于抗体筛查和抗体鉴定, 但在实际操作?#26657;?#38451;性结果偏多。酶法能够显著增强Rh 和Kidd ?#20302;?#30340;抗原抗体反应。但蛋白酶能破坏M、N、S、s、Fya 和Fyb 抗原, 对这类抗原不能用酶处理的方法。酶法虽然敏?#34892;越细擼?#20294;由于以上的一些原因使此类方法的应用受到了限制。瑞士红十字会输血服务中心(BTS SRC) 推荐的使用标准中认为一步酶法不够敏感而应淘汰,但对于怀孕的妇女,增强的两步酶试验是必需的。

    Gerbr H 认为酶法不适合用于日常工作, 过多的阳性结果是由于与临床不相关的因素引起的[ 3 ]。而在芬兰,自20 ?#20848;?0 年代以来,为避免无意义的抗体的干?#29275;?#37238;法已经被淘汰。在英国, 一项对50 776位显示“有记录”的孕?#38236;?#35843;查表明, 初次筛查酶实验的阳?#26376;?#20026;6.6% , 4.7% 再次实验仍为阳性, 仅有1.4% 的样品(731 例) 含有可确认的具有潜在临床意义的红细胞同种抗体, 其中117 例仅能以酶法检出 ; 在117 例中的54 例, 其抗体对胎儿具有潜在临床意义。对这54 例跟踪调查的结果显示只有3例在怀孕的稍后阶?#25991;?#20197;PEG-IA T 法检出抗体(抗D: 0.9 IU/m l ; 抗D1:32 ; 抗c1:1) , 其中只有一个婴儿显示HDN 的迹象。由此可推断酶实验的结果对于胎儿或新生儿患病、死亡的检出率和在产前检查中作用并不?#34892;В?而酶试验的废除和自动处理程序及数据获取的引入将可能压缩巨大的工作量[ 4 ]。同样,在英国也不提倡用酶法进行交叉配血试验,英国国家客观质量评?#20848;?#21010;(N EQA S) 的结果表明,虽然除了IA T 法, 酶法检测弱的Rh抗体也很敏?#26657;?但IA T是检测弱的抗D 的最敏感的方法,这是有实验根据的[ 5 ]。

    4 抗球蛋白试验及其改良方法 抗球蛋白试验是1945 年由Coombs ?#28909;?#24314;立的, 又称为Coombs 试验。抗球蛋白试验的建立在血型血清学上有着非常重要的意义。红细胞表面包被了IgG 抗体分子或补体分子C3、C4 片段, 但不能产生凝集现象, IgG抗体和补体?#38469;?#20154;球蛋白, 用这些人球蛋白免疫动物或用杂交瘤技术可以得到抗人球蛋白, 这类抗体的特异性是针对IgG 分子的Fc ?#20301;?#34917;体C3、C4 片段, 可以和包被在红细胞上的抗体分子和补体分子作用, 使红细胞发生凝集。抗人球蛋白分子起着搭桥的作用。抗球蛋白试验分为直接抗人球蛋白试验(DAT ) 和间接抗人球蛋白试验( IAT )。其传统的方法是以盐水为介?#30465;?#31163;心试管的手段进?#26657;?广泛应用于交叉配血、血型鉴定和抗体筛查。在英国,1985 年只有82% 的检查抗D 项目采用了间接抗人球蛋白试验( IAT ) ,而1992 年达到了98% ,到1994 年则达到了100% [ 6 ]。纵览由加拿大红十字会多伦多中心对安大略省的59 ?#20057;?#38498;在1993 年的调查显示,有2/3 的医院使用IAT 法进行抗体筛查实验[ 7 ]。

    尽管抗人球蛋白试验的试管离心法被认为是在检测红细胞抗体中?#23665;?#21463;的技术, 但有资料显示, 由于标准IAT 试管离心试验中不恰当的判读,1+ 和2+ 的反应很容易搞错(特别是在大规模的筛选中超过20% ) [ 8 ]。由于许多有临床意义的红细胞抗体是IgG, 为提高抗人球蛋白试验的敏?#34892;裕?#21448;出?#20013;?#22810;的改进: 即介质更换为低离子强?#28909;?#28082;(LISS)、聚乙烯乙二醇(PEG) 等。这些改进后的试验在试管或微板中都很敏?#23567;?#20174;N EQA S 提供的资料中可以看出, 在英国?#36864;?#26684;兰差?#27426;?#25152;有的实验室都采用增强的抗人球蛋白法, 通常是使用低离子强度的介质加两步酶法。这些方法被推荐是因为能提高敏?#34892;?#21644;在检测具有临床意义的抗体中有好的表现, 另外在苏格兰N EQA S 的实验中也有非常好的记录[ 6,9 ]Moulds J J 认为在一个熟练的血清学工作者手?#26657;琇 ISS2抗球蛋白实验(A GT ) 和PEG-AGT 一样敏感 ;但是后者会较少产生模棱两可的结果。如果只须检测抗球蛋白反应性抗体, 那么LISS-A GT或PEG-AGT 实验都可?#26376;?#36275;, 但是这两种方法对混合抗体的检测都有缺陷[ 10 ]。从一份来自荷兰的报告?#26657;琌verbeeke M A M 指出他们选择PEG-IA T 法是基于对一大批含有已知抗体的血浆和一大批未知的病?#25628;?#21697;的比较研究而定的。他们发现PEG-IA T 法比使用白蛋白的标准离心试管IA T 法更为敏?#26657;?几种具有临床意义的抗体用PEG-IAT 法能被检出而用白蛋白IA T 法则不能,比如Jka 抗体、Jkb 抗体和E 抗体。这项技术只有一?#37995;?#39064;, IgM 溶血素(比如抗V el 抗体和抗P 抗体) ,使用多特异的抗球蛋白试剂IA T 法能够检出而PEG-IA T 法则不能[ 8,11 ]。抗人球蛋白法主要的问题出在对结果的判读上,特别是如果振摇得太厉害,弱的凝集很容易被打散。当抗人球蛋白法被用于大量样本的实验,而且绝大多数是阴性结果时,保持精确的判读是很困难的。另外, 还存在着操作繁琐、工作量大和耗时长等问题, 使其应用受到了?#27426;?#30340;限制。

    5 低离子凝聚胺试验 1980 年Lalezari 和Jiang首先将凝聚胺技术应用于血库作业上。凝聚胺(polybrene) 是一种高价阳离子季胺盐多聚物,溶解后能产生很多正电荷,可中和红细胞表面的负电荷,使红细胞之间的距离减小,能引起正常红细胞可逆性的非特异性凝集。如果是抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集,则凝集不可逆。在检测抗体活性的凝聚胺试验?#26657;?#32418;细胞与血清首先在低离子介质中孵育,以促进抗体和红细胞结合,然后加入凝聚胺来凝集细胞。在离心后, 凝集的细胞不再悬浮,加入重新悬浮液, 凝聚胺的凝集作用可通过加入枸橼酸钠中和, 使正常红细胞的凝集解散,而抗体引起的凝集仍存在。陈和平等对凝聚胺技术进行改?#36857;?认为改良凝聚胺技术具有快速、简便、灵敏的特点,特别是对Rh?#20302;?#25239;体, 其灵敏度要高于抗人球蛋白法,例如对抗-D 的检测可达1ng/m l, 远高于抗球蛋白法的约10ng/m l, 这一特征为检测弱的Rh?#20302;?#25239;体提供了有力的手段[ 12 ]。1983 年Fisher 比较盐水法、木瓜酶法、低离子盐水抗人球蛋白法和凝聚胺法?#20154;鬧植?#21516;方法检测异体抗体的能力, 发现凝聚胺法检测异体抗体的灵敏度高出其他方法。此后, 欧美的血库实验室陆续采用了该方法。但凝聚胺法仍不能检出所有的不完全抗体,如不能检测出抗-k 抗体, 因此其方法的应用受到了限制。

    6 微管凝胶检测试验 微管凝胶检测方法是近年来逐渐兴起的一项免疫检测新方法。1986 年法国的Dr Yves Lapierre 首先发明此方法, 该方法是把凝胶柱与抗人球蛋白法等结?#26174;?#19968;起, 是生物化学凝胶过滤技术和免疫学抗原体反应相结合的产物。微管凝胶检测技术的关键是凝胶, 通过凝胶的浓度来控制凝胶间隙的大小,使其间隙只能?#24066;?#28216;离的红细胞通过,从而使游离的红细胞与聚集的红细胞分离,达到鉴别反应结果的目的[ 13 ]。如果通过离心,红细胞沉淀在试管底部,则表明红细胞未发生凝集,是阴性反应 ;若红细胞聚集在凝胶带上部, 则表明红细胞发生凝集,呈阳性反应。此外, 凝胶中已经加好了抗人球蛋白及各类血型抗体, 从而简化了操作过程,只需加入样本即可。这类技术在血型鉴定、交叉配血、抗体筛查和鉴定等方面有着广泛的应?#20204;?#26223;。

    凝胶检测技术是一项新技术,目前处于?#26207;?#21644;推广的阶段,也正逐渐被引起重视。加拿大部分医院使用凝胶检测技术进行实验,他们认为凝胶检测技术操作简便,结果?#30528;?#23450;。凝胶检测技术在美国也已引起重视, Garratty G 认为这项研究在同种抗体的检测中有很好的效果。他相信(和希望) 可以很快使所有的相容性实验自动化。美国受血者和献血者的ABO 及D 血型鉴定以及抗体筛查将会实现自动化,也将会采用电子(计算机) 交叉配血, 而凝胶卡可以很容易地实现这个目标[ 8 ]。NEQAS 1994年收到的从380个医院血库反馈的资料显示,在交叉配血实验?#26657;?大约65% 使用低离子浓?#28909;?#28082;离心技术(BTS SRC) 在抗体研究中对凝胶技术的选择是基于在1988-1989 进行的6 个月?#21592;?#23454;验的结果及此后的操作经验。对其它技术的几项较小的研究也巩固了他们的选择。他们认为除了高敏?#34892;?#21644;高特异性, 凝胶实验还具有很高的可重复性、对实验人员?#35272;?#23567;、实验结果能长期保存有随时可以复查结果等优点, 可能还会有迄今未知的优点。但他们仍选择两?#26893;?#21516;的技术程序(传统的离心试管抗人球蛋白法和凝胶技术) 是基于某些患者血浆的病理变化, 比如血浆蛋白?#38485;摇?#24456;强的冷或热抗体?#26085;?#19968;类被称为HLTA 抗体的样本, 用试管法比凝胶法更容易检测出。作为参比实验室, 有问题的样本是很常见的: 超过50% 的交叉配血在不同血型中表现出无法预知的反应。芬兰大约1/3 的医院实验室, 包括3/5 的大学医院选择了凝柱法。KUO P IO 大学医院得到的资料显示, 使用凝胶法筛查, 对于提高抗体被识别的百分?#31034;?#26377;重要的临床意义[ 8 ]。许多已出版的资料显示在检查弱的抗体时, 这种凝胶的抗人球蛋白方法达到或超过传统的抗人球蛋白方法。Voak D 和O uvehandW H 已研究出?#20848;?#26032;方法和正确使用L ISS IA T 法的快速确认技术。这项工作和许多报道过新IA T 法的文章都表明, 使用新的抗球蛋白法即凝胶技术和聚乙烯乙二醇(PEG) 离心抗球蛋白法的效果都至少等同于L ISS 试管离心抗球蛋白法。因此如果正确使?#37238;?#36136;量的筛选细胞, 它们都能满足抗体筛查实验[ 14 ]。另外从英国N EQAS 的数据可以证明这些,对1 例弱的抗2c 抗体使用试管间接抗球蛋白法的188 名实验者中有38 名漏检, 而采用微管法的53人中只有1 人漏检[ 6 ]。凝胶检测技术因其敏?#23567;?#26131;操作和判读结果的时间?#27573;?#36739;长等许多优点日趋广泛的被应用[ 13, 15,16 ]。

    由于凝胶技术的关键是在凝胶的质量方面的控制, 所以凝胶卡的变异也同样引起了重视。从两家使用D iaM ed2ID 凝胶卡的在大学医院反馈回芬兰红十字会血液中心的资料表明, 交叉配血实验中得到的直接抗人球蛋白实验阳性结果的数目难以置信地高(1:400) , 第三家使用传统方法的实验室数字却很低(1:3 000) , 他们认为, 至少有一些批次的DiaM ed 实验卡对红细胞表面的非常弱的IgG具有过高的敏?#34892;浴?#20957;胶卡的变异和ABO的兼容性(即B 血浆和A2B 细胞相容) 可能会造成凝胶卡的错检。这在英国的精密实验中被首次发现并已被Cummuns和Downham 所证实, 他们认为凝胶微柱技术在交叉配血实验当中的应用还有待于更进一步的研究[ 17 ]。按照西班牙最近颁布的法律,在西班牙进行交叉配血时, 为检测ABO 和其它不相容的可能, 盐水法和传统的抗人球蛋白法将被淘汰。因为凝胶卡的优点和可自动化操作, 其应用将大为增加[ 18 ]。这提示在其他国家广泛采用凝胶技术检测红细胞血型抗体将成为一种趋势。


    小  结

    盐水介质凝集试验具有操作简便、省时和耗用低的优点, 但因为检测灵敏度低和对不完全抗体的低敏?#34892;?#30340;致命缺陷, 同时还存在结果不稳定和不?#30528;?#35835;的缺点, 使此类方法已被淘汰。胶体介质凝集试验提高了反应的灵敏度, 但这类方法因为存在操作复杂、判读结果难以实现标准化等问题,目?#23433;?#29992;?#27426;唷?#25239;球蛋白检测技术及其各类传统的改进技术有着灵敏度高、特异性强等优点,但存在结果判读困?#36873;?#19981;能保存的缺点。凝聚胺法因为仍不能排除不完全抗体的影响, 因此其方法的应用受到了限制。微管凝胶检测技术是红细胞血型抗体检测技术的一个进步,这种进步主要表现在操作简便、结果稳定?#20057;子?#21028;读、重复性好、可长期保存甚?#37327;?#20197;通过?#37327;?#26426;实现自动化,对有临床意义的抗体具有足够的敏?#34892;?#21644;?#32454;?#30340;特异性, 但由于凝胶的工艺要求?#32454;擼?其检测技术尚待进一步?#26207;啤?#20256;统的(包括在此基础?#32454;?#36827;的) 抗球蛋白检测方法仍在红细胞血型抗体检测和筛查中起着重要作用, 而很多的?#21592;妊?#31350;显示,某些抗体使用一种方法能够检出而另一种则不能, 我们应该考虑使用一种联合的方法以确保抗体筛查的安全性。根据PT 的经验和观察,他们也认为在常规实验室抗体筛查和交叉配血最好的方法是抗球蛋白法结合凝胶技术。但随着凝胶技术的?#27426;賢晟疲?凝胶检测?#27573;?#30340;拓展, 凝胶检测技术将取代传统的抗球蛋白法。


    参 考 文 献

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    (收稿日期: 2001211216)
    (来源: 来宝网 )


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