• <div id="y09gn"></div>
  • <li id="y09gn"></li>
    <dl id="y09gn"></dl>
    <div id="y09gn"><s id="y09gn"></s></div>
    来宝网Logo

    热门词:生物显微镜 水质分析仪 微波消解 荧光定量PCR 电化学工作站 生物安全柜

    现在位置首页>技术资料首页>实验技术>生物技术>腺病毒体外在293细胞中大量扩增的方法

    腺病毒体外在293细胞中大量扩增的方法

    上海宝特生命科学发展有限公司2010年11月16日 11:09 点击:1605

     

    293 细胞中大量扩增腺病毒

    一旦重组病毒已被纯化和鉴定,?#32431;?#22312;293 细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法,按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011~3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000~10000,因此1L 培养细胞可得到约5×1012 病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化,则必须至少3×108 的细胞,这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达,则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止,离心沉淀细胞后按照?#23454;?#30340;操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。为优化时间进程,每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步,则必须将病毒冻存,直?#26009;?#19968;次细胞培养开始后再融化病毒。注意?#30475;?#25193;增都将会剩下一些病毒,这些病毒先不必丢弃,?#21592;?#19979;一步扩增失败时备用。?#30475;?#25193;增最好都用最低代的病毒颗粒,这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。

    操作步骤:

    1 在100mm 培养皿或75cm2 培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 293 细胞。

    2 取0.5ul 首次扩增的病毒保存?#28023;?#21152;入DMEM5%至1ml,混匀,这样稀释得到的MOI 值约为5。

    3 移去培养?#28023;?#23567;心加入病毒混合?#28023;?#20999;勿破坏细胞单层,十?#20013;?#24930;慢晃动3 次,37℃ CO2 孵箱中培养90 分钟。

    4 加入9ml DMEM5%。

    5 再培养72 小时,这时在10ml 溶液中大约有5×109~5×1010 个病毒颗粒,进行MOI 测定以估计病毒颗粒。

    注:如果此时得到的病毒量已足够,可立即进行病毒滴度测定。收集细胞,600×g 离心5 分钟沉淀细胞,去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10 即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。-200C /370C 冻融3 次,台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片,收集上清,然后进行病毒滴定。

    1  -20℃/37℃冻融3 次。

    2转入15ml 无菌离心管中,台式离心机上以最大速率离心10 分钟,收集上清冻存于-20 ℃或-80 ℃。

    3  3 个175cm2 培养瓶中各加入107 293 细胞进行培养。

    4  将3ml 细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中,混?#21462;?#31227;去细胞培养?#28023;科?#23567;心加入5ml 混合?#28023;?#21313;?#20013;?#24930;慢晃动混匀3 次,370C 5%CO2 孵箱中培养90 分钟。此时MOI 值约为25。

    5 加入DMEM5%至30ml。

    6 再培养48~72 小时。此时10ml 培养液病毒量约为3×1010~3×1011。若需要,进行MOI 测定以估计病毒滴度。

    注:如果此时病毒量已可?#26376;?#36275;实验所需,则可立即进入病毒滴定步骤。600×g 离心5 分钟收集细胞,弃上清,加入1/10 原始体积的溶液重悬细胞。-200C /370C 冻融3 次,台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片,收集上清,进行病毒滴定。

    12. 移入50ml 离心管中,台式离心机上最大速率离心10 分钟,取出上清保存。

    13. 30 瓶175 cm2 培养瓶中?#31185;?#21508;加入107 293 细胞。

    14. 将45ml 细胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混匀,从培养瓶中移去培养?#28023;?#21152;入5ml 混合液感染细胞,十?#20013;位?#24930;晃动3 ?#20301;?#21248;,370C 培养90 分钟。此时MOI 值约为25。

    15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。

    16. 再培养48-72 小时,此时约有3×1011~3×1012 个病毒。若需要,进行MOI 测定估计病毒滴度。

    如果要收集病毒颗粒,先收集被感染细胞,然后重悬在5ml DMEM5%中。-200C /370C 冻融3 次,离心沉淀细胞碎片。此时5ml DMEM5%中3×1011~3×1012 个病毒颗粒,浓度为6×1010~6×1011vp/ml。然后测定病毒滴度,或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。

    在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存?#28023;?#32780;在1010 细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞,因这会大大增加RCA 产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA 产量。如果已没有纯化的空斑,那么就不得不重新空斑纯化重组病毒,鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增4 轮后的病毒量,注意请用早期的病毒作为扩增源。比如,用第2 代病毒产生第3 代病毒。如果没有第2 代病毒,那么必须用第1 代病毒来产生新的第2 代病毒。按这个原则进行扩增可使RCA 水平尽可能低。

    如果用于表达蛋白,则可以收集细胞后根据蛋白特点选择?#23454;?#26041;法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg 蛋白,建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间,然后再大量扩增蛋白。

    腺病毒扩增

    第一代

    第二代

    第三代

    第四代

    ?#31185;?#32454;胞数

    1×105

    5×106

    1×107

    1×107

    培养瓶大小(cm2)

     

    75

    175

    175

     

     

    培养瓶数

    24 孔板1 孔

    1

    3

    30

     

     

    首次扩增后的病

     

     

    感染来源

    稀释的空斑

     

    第二代病毒

    第三代病毒

     

     

    毒保存液

     

     

     

     

    0.5 mL 或

     

     

    ?#31185;?#25509;种量

    0.1 mL

     

    1 mL

    1.5 mL

     

     

    2.5×107

     

     

    总培养体积

    1 mL

    10 mL

    90 mL

    900 mL

    MOI

    0.01

    5

    25

    25

    滴度(VP/mL)

    1×108~9

    5×108~9

    3.3×108~9

    3.3×108~9

    总病毒量

    1×108~9

    5×109~10

    3×1010~11

    3×1011~12

    (来源: 上海宝特生命科学发展有限公司


    全年征稿 / 资讯合作

    联系邮箱:[email protected]

    版权与免责声明

    • 凡本网注明“来源:来宝网”的所有作品,版权均属于来宝网,转载请必须注明来宝网, http://www.67994619.com,违反者本网将追究相关法律责任。
    • 本网转载并注明自其它来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
    • 如涉及作品内容、版权?#20219;?#39064;,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为?#29260;?#30456;关权利。


    云南11选5技巧
  • <div id="y09gn"></div>
  • <li id="y09gn"></li>
    <dl id="y09gn"></dl>
    <div id="y09gn"><s id="y09gn"></s></div>
  • <div id="y09gn"></div>
  • <li id="y09gn"></li>
    <dl id="y09gn"></dl>
    <div id="y09gn"><s id="y09gn"></s></div>
    彩3d马后炮解太湖字谜 德州扑克2中文版 买彩票中大奖前的征兆 大赢家高手论坛高手帖 网上百家乐 15选5预测 彩票网站源码 开奖结果 全天时时彩5星计划网页 法甲联赛积分榜最全榜单 安徽十一选五今天预测 澳洲幸运5 排球初学者训练计划 地下六合彩獎金 六合图库资料网站