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    食物中葡萄糖的测定

    来宝网2007年11月5日 8:42 点击:2757

    葡萄糖氧化酶法
    1.
    原理
       
    葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢,过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质,此有色物质在625nm 波长下与葡萄糖浓度成正比。通过测定蓝色物质的吸光度可计算样品中葡萄糖的含量。
    2.
    适用范围
       
    适用于谷类、乳类、饮料、酒类等食物样品和血液样品。检出量为0.02 mg
    3.
    仪器
            722
    分光光度计。
    4.
    试剂:
       
    除特殊说明外,实验用水为蒸馏水,试剂为分析纯。
    1 乙醇。
    2 40% 三氯乙酸:称取40g 三氯乙酸,用水溶解并稀释至100ml
    3 2 mol/L NaOH 溶液:称取8g NaOH 用水溶解并稀释至100ml
    4 1 % 邻联甲苯胺溶液:称取0.1 g 邻联甲苯胺溶解于10 ml无水乙醇中,倒入棕色瓶中,4 冰箱保存。
    5 乙酸缓冲液 pH 5.0):称取14.28 g 乙酸钠 CH3COONa•3H2O)溶于水中,加入2.7 ml 冰乙酸,并调节pH 5.0 用水定容至1 L
    6 葡萄糖氧化酶溶液:称取一定量的葡萄糖氧化酶(Sigma 公司)用水溶解,使酶含量为100 U/ml4 冰箱保存一周。
    7 过氧化物酶溶液: 0.010 g 辣根过氧化物酶溶于10 ml 水中,4 冰箱保存一周。
    8 酶溶液:取100 ml 乙酸缓冲液,分别加入邻联甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、过氧化物酶溶液各1 ml,混?#21462;?/SPAN>4 冰箱可保存七周。
    9 酶空白液:取100 ml 乙酸缓冲液,分别加入邻联甲苯胺溶液、过氧化物酶溶液各1 ml,混?#21462;?/SPAN>4 冰箱保存一周。(注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶)
    10 葡萄糖标准液:将葡萄糖标准品(纯度大于99%)于80 干燥至恒量。精确称取0.050 g,用水移入100 ml 容量瓶中,定容?#37327;?#24230;线。相当于浓度为0.5 mg/ml
    5.
    操作步骤:
    5.1
    样品处理:
    1)固体样品:称取0.55g已粉碎的样品于锥形瓶中,加入50ml水后沸水浴15min。冷却后,转移至100ml容量瓶中并用水定容?#37327;?#24230;。反复摇动混匀样品,过滤,弃初?#25216;?#28404;滤液。收集滤液。如果滤液澄清,可?#33519;?#25110;经进一步稀释后用于测定。如果滤液浑浊,吸取20ml滤液转移至另一容量瓶中,加入无水乙醇?#37327;?#24230;。混合后静置至少30min。过滤,滤液用于测定。
    2 液体样品,寡糖、淀粉等碳水化物水解液:吸取210ml样品或水解液,加入4倍量乙醇,混和。静置至少30min,过滤后滤液备用。(如果过滤后滤液仍浑浊,或样液体积过少,可3000rpm离心15 min,上清液备用。)
    3 新鲜牛乳等样品:吸取0.52ml 样品,用水稀释,加入3ml 40% 三氯乙酸溶液。用水定容至100ml,过滤。吸取5ml 滤液,用2 mol/L NaOH 调节pH至中性,用水定容至10ml,备用。
    (注:样品处理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白质,40% 三氯乙酸用于沉淀蛋白。)

    5.2测定:标准管和样品测定管,按下表所列操作(单位:ml

     

    标准空白管

    葡萄糖标准管

    样品空白管

    样品测定管

    葡萄糖标准液

    ——

    0.10.5

    ——

    ——

    样品提取液

    ——

    ——

    0.5

    0.5

    0.5

    补至0.5

    ——

    ——

    酶溶液

    5

    5

    ——

    5

    酶空白液

    ——

    ——

    5

    ——


    上述试剂混合后37 水浴反应 15 min 625 nm 测定吸光度值。
    (注意:葡萄糖与酶溶液的成色反应与反应时间密切相关,如反应时间过长,溶液颜色会由蓝转变成灰色,并慢慢产生沉淀,所以反应时间应严格控制好。)
    6.
    计算
    根据吸光度?#30331;?#20986;葡萄糖标准曲线的回归方程,采用插入法求出样品测定管中葡萄糖含量,再根据稀释定容体积和称样量,计算出样品中葡萄糖含量。
    计算公式:
    X= (As-Ab)×V×F×0.1
    0.5×m
    式中:
    X——
    样品中葡萄糖含量,g/100g;
    As——
    由标准回归方?#31958;?#20986;的样品测定管中葡萄糖含量,mg
    Ab——
    由标准回归方?#31958;?#20986;的样品空白管中葡萄糖含量,mg
    V——
    样品定容体积,ml
    F——
    稀释倍数
    0.5——
    测定时吸取样品提取液的体积,ml
    m——
    样品质量,g
    0.1——
    mg/g



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